染料木素對人宮頸癌細胞株HeLa增殖的影響

鄭秋玲，聶少平，李文娟，胡曉娟，謝明勇

染料木素(genistein，Gen)，又稱為金雀異黃酮、染料木黃銅，是異黃酮的主要成分，其性質穩(wěn)定，且毒副作用小，是一種已被廣泛認知的、最為常見的且活性最為顯著的植物雌激素之一［1］。其結構與人體內源性雌激素相似，并可競爭與雌激素受體(estrogen receptor，ER)結合，從而能夠發(fā)揮抗雌激素作用以及類雌激素作用［2］。近年來，因植物雌激素毒副作用小，且食源含量高，越來越引起人們的關注與重視。研究證實，植物雌激素具有抗癌、抗氧化、抑制骨質疏松等積極治療作用［3－5］。流行病學調查研究表明，東方國家因其飲食習慣中豆類食物豐富，其乳腺癌、前列腺癌以及心血管疾病等患病率明顯低于西方國家［6］。在人們大力提倡攝入植物雌激素的同時，有關植物雌激素安全性的問題也逐漸引起了大家的重視。然而，因各地區(qū)種族差異性以及各研究團隊研究方法的不一致性，其結果一直具有爭議性。

宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有持續(xù)上升的趨勢［7］。然而，有關宮頸癌的研究卻較少，遠不及對乳腺癌的研究。研究表明，宮頸癌發(fā)生、發(fā)展與體內雌激素水平密切相關［8］，但具體作用機制及與食源性植物雌激素的關系不詳。本實驗試圖探討染料木素對宮頸癌細胞增殖的影響，以期為染料木素對宮頸癌的影響及作用機制提供進一步的實驗基礎以及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及試劑 人宮頸癌細胞系(HeLa)，購買自美國ATCC;Gen，純度99%以上，溶于DMSO，配制成母液、雌二醇(E2)，美國Sigma公司;兔抗人ERα，美國Abcam公司;活性炭處理過的胎牛血清(CDT-FBS)，美國Hyclone公司;DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司;四甲基偶氮唑藍溶液(MTT)，中國索萊寶公司;細胞周期檢測試劑盒，中國碧云天公司;細胞凋亡檢測試劑盒，中國凱基生物公司。

1.1.2 儀器與設備 流式細胞儀，美國BD公司;3K15-高速冷凍離心機，美國Sigma公司;凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，中國深圳國華電器有限公司;METTLER TOLEDO AL104電子天平，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司;CO2培養(yǎng)箱、E-330酶標儀，美國Thermo公司;超凈工作臺，中國吳江市凈化設備總廠;倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 貼壁生長HeLa細胞用無酚紅含10%CDT-FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃，體積分數(shù)5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)良好，傳代或進行實驗處理。傳代時棄原培養(yǎng)液，以PBS洗滌1－2次，然后加入0.25%胰酶消化細胞，離心(1 000 r·min－1，5 min)，加入新培養(yǎng)液重懸，接種于新培養(yǎng)瓶。

1.2.2 實驗分組 MTT檢測，對照組:等體積的DMSO(體積含量比為0.1%);雌二醇陽性對照組(E2):0.01 μmol·L－1E2;Gen 組:0.001、0.01、0.1、1、10 μmol·L－1染料木素處理細胞。藥物刺激48、72 h后檢測。細胞周期、細胞凋亡檢測的分組同上，藥物刺激48 h后檢測。Western blot檢測ERα表達，對照組:等體積的DMSO(體積含量比為0.1%);Gen 組:用 0.1 μmol·L－1Gen 刺激 HeLa細胞 3、6、12、24 h。

1.2.3 MTT法檢測細胞生長 用傳代的方法將細胞制成1×107·L－1的細胞懸液接種于96孔板內，每孔200 μl，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加藥，每個濃度設6個復孔，培養(yǎng)48、96 h后，每孔加入20 μl的 MTT(5 g·L－1)，繼續(xù)孵育4 h 后取出96孔板，將液體棄凈，每孔加入150 μl DMSO溶液，振蕩10 min后檢測其在490 nm處的吸光值，計算平均OD值及增殖率(PR):PR/%=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期變化 用0.25%的胰酶消化、收集細胞，制成5×108·L－1濃度的細胞懸液，接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后加藥，加藥48 h后收集細胞。收集的細胞用PBS洗滌兩次，每次1 000 r·min－1離心5 min。棄上清，加入PBS混勻細胞，再加入無水乙醇，使乙醇的體積分數(shù)為0.75，固定24 h(4℃)后棄去固定液，PBS洗滌細胞后加入100 μl RNase，水浴37℃孵育30 min，最后加入 400 μl Propidium Iodide(PI)染液，水浴37℃孵育30 min。應用流式細胞儀測定細胞周期變化。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集HeLa細胞，制成單細胞懸液接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱孵育24 h后加藥，48 h后收集細胞。用PBS洗滌兩次，每次離心 5 min(1 000 r·min－1)。加入 500 μl緩沖液懸浮細胞，加入 Annexin V-FITC、PI各 5 μl，混勻，室溫、避光反應5 min，1 h內檢測細胞凋亡變化。

1.2.6 Western blot方法檢測ERα蛋白表達 根據(jù)MTT檢測細胞生長的數(shù)據(jù)，采用對HeLa細胞增殖作用較為明顯的染料木素濃度(0.1 μmol·L－1)刺激HeLa細胞，分別作用3、6、12及24 h后收集細胞，提取核蛋白。根據(jù)目標蛋白分子(ERα蛋白和β-actin)量配制10%SDS-PAGE凝膠，根據(jù)蛋白濃度，調整上樣量一致后進行電泳。常規(guī)進行轉膜操作，牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉1 h。ERα抗體按1∶1 000稀釋，于4℃過夜，洗脫后二抗孵育，輕搖1 h，洗脫后ECL顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)成像檢測分析(以β-actin作為內參)。

2 結果

2.1 培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細胞的一般特性 在倒置顯微鏡下觀察，HeLa細胞貼壁生長，排列緊密，細胞體積較大，細胞為梭形或扁平多邊形，邊界清晰，胞質豐富。見Fig 1。

Fig 1 Features of HeLa cells

2.2 MTT結果 Gen對HeLa細胞生長的作用如Fig 2所示。實驗濃度的 Gen(0.001～10 μmol·L－1)均促進了HeLa細胞的生長，且隨著作用時間的增加作用效果更加明顯。濃度為0.1 μmol·L－1的Gen作用72 h后增殖效果最明顯，OD值為(1.992±0.055)，與對照組的(1.247±0.086)相比，差異具有顯著性(P＜0.05)，且增殖作用大于陽性對照組E2組(OD值=1.827±0.034)。

2.3 染料木素對HeLa細胞周期的影響 由流式檢測結果Fig 3可知，在Gen的作用下，HeLa細胞S期細胞比例有所增加，G1期比例降低，并且在0.01 μmol·L－1的Gen的作用下，細胞周期的變化最明顯，S期比例由(24.68±4.38)%增加到(38.84±3.80)%，其效果較E2更為明顯。見Tab 1。

2.4 染料木素對HeLa細胞凋亡的影響 經(jīng)Gen刺激48 h后，HeLa細胞凋亡率明顯下降。與對照組相比(凋亡率為24.37±0.78)，Gen在0.1 μmol·L－1濃度下作用效果最為明顯(凋亡率為8.77±1.23)，其效果較E2更為明顯(凋亡率為11.29±2.92)。見Tab 2。

Fig 2 Effect of Gen on proliferation of HeLa cells

Fig 3 Effect of Gen on cell cycle of HeLa cells

Tab 1 Effect of Gen on cell cycle of HeLa cells

Tab 2 Effect of Gen on apoptosis of HeLa cells

2.5 染料木素對HeLa細胞ERα表達的影響 研究表明，雌激素可通過調節(jié)雌激素受體，進而影響細胞增殖［9］。因此，本研究進一步檢測Gen對雌激素受體ERα的影響。如Fig 4所示，與對照組相比，Gen刺激6 h后，HeLa細胞中ERα表達量明顯上調，在24 h后與對照組差異無顯著性。

Fig 4 Effect of Gen on ERα expression in HeLa cells

3 討論

目前，研究顯示植物雌激素對宮頸癌的增殖具有抑制作用［10］，但多是研究其在高濃度下(一般大于10 μmol·L－1)的作用。然而，攝入的食源性植物雌激素的濃度是否能達到該濃度仍有待考察，且因不同地區(qū)飲食習慣的不同，攝入的植物雌激素濃度高低不同。因此，除考察其高濃度作用效果外，探討植物雌激素在低濃度下對宮頸癌增殖作用的影響具有重要的意義。研究表明，植物雌激素在低濃度下能夠發(fā)揮類雌激素作用［11］，因此，本實驗以人宮頸癌HeLa細胞為研究對象，應用低劑量植物雌激素Gen，選取內源性雌激素E2作為陽性對照，考察Gen對宮頸癌的影響。MTT實驗結果表明，實驗濃度的染料木素(0.001 ～10 μmol·L－1)都能夠對HeLa細胞的增殖起到促進作用，該作用結果與E2相一致。

眾所周知，為保持細胞的正常運行，細胞內部有著精密的調控機制。細胞周期是生命活動中的一個非常重要的過程，具有非常復雜和精細的調節(jié)機制及過程，對它的研究是現(xiàn)代生命科學研究的一個重要內容。細胞周期分為間期和有絲分裂期，細胞間期又分為休眠期(G0)、DNA合成前期(G1)、DNA合成期(S)以及DNA合成后期(G2)。下一階段的開始依賴于前一階段的完成，而各個階段之間的銜接依賴于很多調控因子。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞周期發(fā)生紊亂從而導致細胞失控性生長有關［12］。用Gen刺激HeLa細胞48 h后，流式細胞儀檢測細胞周期，結果表明，與對照組相比，實驗組S期細胞比例有所增加，G1期細胞比例有所下降，表明Gen可能通過對細胞周期的調控從而達到促進HeLa細胞增殖的作用。

細胞凋亡是細胞在外界環(huán)境的影響下為了更好的適應環(huán)境在一系列基因的調控下主動有序死亡的過程，凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有著密切的關系［13］。本實驗中，與細胞周期的Gen作用時間相對應，用Gen作用HeLa細胞48 h后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化。結果顯示，與對照組相比，實驗各組的凋亡率均明顯降低，表明Gen也可能通過對細胞凋亡的抑制進而影響細胞增殖。

ERα是被廣泛認知的一種雌激素受體，廣泛分布于人體各組織中，能夠與內源性及外源性雌激素表現(xiàn)出相似的結合特性。在無雌激素存在的情況下，ERα以抑制性復合體形式存在，而雌激素與ERα結合后則能夠與靶基因上的雌激素反應元件結合，激活靶基因，在無雌激素反應元件基因的細胞中，ERα也能夠通過調節(jié)一些轉錄因子的活性調節(jié)靶基因的表達，ER在體內參與的信號通路復雜，對靶基因的調節(jié)依賴于不同的細胞類型。在一些生殖器官癌細胞中如乳腺癌MCF-7細胞以及卵巢癌細胞中都檢測到了ERα的高表達［14］，因此，對宮頸癌細胞中ERα的表達及其作用的研究有著至關重要的作用。本實驗結果表明，在宮頸癌細胞中也同樣發(fā)現(xiàn)了ERα高表達的現(xiàn)象。

綜上所述，Gen可能通過上調ERα的表達量，激活一系列調控細胞周期及細胞凋亡的基因表達，從而促進了HeLa細胞的增殖。然而，Gen在細胞內參與的信號轉導通路及其相互間的作用方式仍有待進一步的實驗探究。

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