三七皂苷R1對(duì)肺高壓大鼠模型肺動(dòng)脈的舒張作用

胡 瑩，焦海霞，王瑞幸，郭立成，穆云萍，林默君

肺高壓(pulmonary hypertension，PH)是指由異源性疾病和不同發(fā)病機(jī)制引起的以肺動(dòng)脈壓力增高為表現(xiàn)的疾病狀態(tài)［1－2］，其主要病理改變?yōu)榉窝茏枇M(jìn)行性增加，進(jìn)而引起肺動(dòng)脈壓力增高、肺血管重塑，最終引起右心衰竭甚至死亡［2］。所以，PH屬于進(jìn)展性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterialsmooth muscle cells，PASMCs)膜上主要存在3種鈣離子通道:L-型電壓依賴性鈣離子通道(L-VDCC)、受體操縱性鈣離子通道(receptor-operated calcium channels，ROCC)和鈣池操縱性鈣離子通道(store-operated calcium channels，SOCC)，這3個(gè)通道共同參與細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持［3］。我們先前的工作證實(shí)，在慢性低氧(chronic hypoxia，CH)暴露和野百合堿(monocrotaline，MCT)單劑量注射誘導(dǎo)的兩種PH模型的肺動(dòng)脈(pulmonary arteries，PAs)上，SOCC 表達(dá)上調(diào)，所介導(dǎo)的鈣池操縱性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry，SOCE)和血管收縮均明顯增強(qiáng)［4－5］。目前，PH治療藥物主要包括前列環(huán)素、內(nèi)皮素以及NO類似物［6］，但這些藥物僅能部分改善PH癥狀，對(duì)PH預(yù)后并不理想。

三七總皂苷(panaxnotoginseng，PNGS)是從傳統(tǒng)中藥三七中提取的活性成分，具有抑制由二磷酸腺苷(ADP)引起的血小板聚集、擴(kuò)張腦血管、抗血栓和抗凝血作用。三七皂苷R1(notoginsenoside R1)是PNGS的主要活性成分之一［6］，近期有研究發(fā)現(xiàn)［7］，三七皂苷R1能夠抑制血小板膜上的非電壓依賴性Ca2+通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，降低血小板活性。但這種傳統(tǒng)中藥單體能否抑制PH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上SOCE的作用目前未見報(bào)道。本研究采用CH和MCT致PH模型，檢測(cè)三七皂苷R1對(duì)模型大鼠肺動(dòng)脈的舒張效應(yīng)，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 兩種肺高壓模型的建立 健康SD大鼠，♂，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK(閩)2012－0001］，隨機(jī)分成正常對(duì)照組(CON組)、慢性低氧模型組(CH組)和MCT模型組(MCT組)。CON組:SD大鼠正常飼養(yǎng)3周;CH組:大鼠置于常壓、密封的有機(jī)玻璃箱內(nèi)飼養(yǎng)，箱內(nèi)的氧分壓降至10.0%±0.5%;MCT組:SD大鼠以20 mg·L－1的MCT按60 mg·kg－1劑量一次性腹腔注射。兩種模型大鼠均正常飼養(yǎng)3周。

1.2 右心室內(nèi)壓測(cè)定 SD大鼠腹腔注射肝素(Heparin，50 IU·kg－1)，5 min 后氨基甲酸乙酯(1 g·kg－1)腹腔麻醉，做右頸外靜脈插管直到右心室，記錄大鼠右心室平均內(nèi)壓(mean right ventricle pressure，MRVP)和右心室收縮壓 (right ventricle systolic pressure，RVSP)。

1.3 右心室重量指數(shù)測(cè)定 測(cè)完右心室內(nèi)壓，迅速開胸取出心臟及肺。沿房室交界處剪去左右心房及大血管，分離右心室(RV)及左心室+室間隔(LV+S)，用濾紙吸去多余水分，分別稱重，計(jì)算RV/(LV+S)，即右心室重量指數(shù) (right ventricular mass index，RVMI)。

1.4 肺動(dòng)脈血管張力檢測(cè) 測(cè)完右心室內(nèi)壓，迅速開胸取出肺葉，在體視顯微鏡下分離肺葉內(nèi)的肺小動(dòng)脈，并將其剪成約4～5 mm的肺動(dòng)脈環(huán)，將去內(nèi)皮后的血管環(huán)置于四腔浴槽中，并予1 g負(fù)荷，經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換后在RM6240C多道生理記錄儀(成都儀器廠)上描記張力曲線，平衡2h。實(shí)驗(yàn)前給予60 mmol·L－1KCl收縮血管，重復(fù)3次，連續(xù)兩次得到的收縮幅度差小于10%則認(rèn)為標(biāo)本反應(yīng)可重復(fù)，否則棄之。血管環(huán)加入苯腎上腺素(終濃度0.1 μmol·L－1)，待預(yù)收縮反應(yīng)達(dá)平臺(tái)后，加入乙酰膽堿(10 μmol·L－1)，觀察其對(duì)血管的舒張效應(yīng)，以驗(yàn)證血管環(huán)內(nèi)皮去除與否，血管環(huán)出現(xiàn)明顯舒張的棄之。隨后，觀察內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1，Sigma)或環(huán)匹阿尼酸(Cyclopiazonic acid，CPA，Sigma)預(yù)收縮作用后三七皂苷R1(成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)或釓離子(gadolinium，Gd3+，Sigma)的抑制作用，各種藥物誘發(fā)PAs的收縮作用以60 mmol·L－1KCl收縮效應(yīng)的百分?jǐn)?shù)來標(biāo)準(zhǔn)化;用以下公式計(jì)算阻斷劑的抑制率:

2 結(jié)果

2.1 PH大鼠模型鑒定 大鼠慢性低氧飼養(yǎng)3周后，MRVP和 RVSP從 CON組(n=17)的(1.5±0.4)kPa和(3.7±0.6)kPa分別增加到CH組(n=17)的(2.6±0.7)kPa(P＜0.01)和(7.1±1.1)kPa(P＜0.01);大鼠以 20 mg·L－1的 MCT按60 mg·kg－1劑量一次性腹腔注射，3周后，MRVP和RVSP分別增加到MCT組(n=21)的(4.0±1.6)kPa(P＜0.01)和(8.1±2.4)kPa(P＜0.01);而CH和MCT組體循環(huán)動(dòng)脈壓和心率均沒有差別［8］，提示右心室內(nèi)壓增高。RVMI從CON組的27.6%±2.8%分別增加至38.6% ±5.0%(CH組，P＜0.01)和46.7% ±14.1%(MCT組，P ＜0.01)，表明右心重構(gòu)，右心室肥大，提示兩種PH大鼠模型制備成功 (Fig 1)。

Fig 1 Mean right ventricle pressure(MRVP)，right ventricle systolic pressure(RVSP)and right ventricle mass index(RVMI)in different groups

2.2 三七皂苷R1呈劑量依賴性阻斷ET-1對(duì)PAs的預(yù)收縮效應(yīng) CON組大鼠觀察三七皂苷R1對(duì)10 nmol·L－1ET-1預(yù)收縮去內(nèi)皮PAs的劑量依賴性舒張效應(yīng)。在 3 μmol·L－1的硝苯地平(Nifedipine，Nif)阻斷L-VDCC后，以10 nmol·L－1ET-1預(yù)收縮PAs，在 ET-1收縮反應(yīng)達(dá)穩(wěn)定后，加入不同劑量(0.1 ～100 μmol·L－1)的三七皂苷 R1，結(jié)果顯示:三七皂苷R1呈劑量依賴性阻斷ET-1預(yù)收縮的PAs，最大舒張效應(yīng)為Emax為32.5% ±16.3%，EC50為 5.25 ±0.14 μmol·L－1(n=8，F(xiàn)ig 2)。

Fig 2 The dose-dependent curve of notoginsenoside R1 on ET-1(10 nmol·L －1)-preconstricted PAs of control rats

2.3 Gd3+和三七皂苷R1對(duì)PH大鼠ET-1預(yù)收縮PAs的阻斷效應(yīng) CH組和MCT組大鼠去內(nèi)皮PAs經(jīng)10 nmol·L－1ET-1預(yù)收縮達(dá)穩(wěn)定后，加入可特異性阻斷SOCC的Gd3+(3 nmol·L－1)后，PAs張力均明顯下降，CH組由117.8% ±20.8%下降至31.9%±8.2%(n=15，P ＜0.01)，MCT組由 111.0% ±26.5%下降至30.8% ±9.5%(n=15，P＜0.01)，兩組再分別加入6 μmol·L－1三七皂苷R1沒有出現(xiàn)進(jìn)一步的舒張作用(CH組:28.0% ±9.2%，MCT:27.2% ±10.5%，F(xiàn)ig 3)。提示:在 3 nmol·L－1Gd3+特異性阻斷SOCE后，三七皂苷R1不能進(jìn)一步對(duì)ET-預(yù)收縮的PAs產(chǎn)生舒張作用。

2.4 三七皂苷R1對(duì)CPA預(yù)收縮PH大鼠PAs的舒張作用 CH組和MCT組大鼠去內(nèi)皮PAs，肌漿網(wǎng)鈣泵特異性抑制劑 CPA(10 μmol·L－1)預(yù)收縮達(dá)穩(wěn)定后，分別加入6 μmol·L－1三七皂苷 R1，觀察其對(duì)CPA預(yù)收縮PAs的阻斷作用。結(jié)果顯示，6 μmol·L－1三七皂苷 R1能部分阻斷 CPA預(yù)收縮PAs效應(yīng)，CH組由116.9% ±25.2%下降至76.1%±23.4%，抑制率為 39.6% ±17.0%(n=7，P＜0.01，F(xiàn)ig 4);MCT組由105.7% ±30.0%下降至70.3% ±270.8%，抑制率為40.9% ±11.2%(n=14，P＜0.01，F(xiàn)ig 4)。提示:三七皂苷 R1可通過阻斷SOCE，舒張PH大鼠的PAs。

Fig 3 Vasorelaxant effects of Gd3+(3 nmol·L －1)and notoginsenoside R1(6 μmol·L －1)on ET-1(1 nmol·L －1)-preconstricted PAs of CH-and MCT-treated rats

Fig 4 Vasorelaxant effects of notoginsenosideR1(6 μmol·L －1)on CPA(10 mol·L －1)-preconstrictedPAs of CH-and MCT-treated rats

3 討論

三七總皂苷是五加科人參屬植物三七的主要有效活性成分，包含多種皂苷單體，具有擴(kuò)張血管、降低心肌耗氧量、減輕心肌炎損傷、抑制血小板凝集、延長(zhǎng)凝血時(shí)間、降血脂、清除氧自由基、抗炎、抗氧化等藥理作用，主要用于心腦血管系統(tǒng)疾病的治療［6］。三七皂苷單體R1是三七總皂苷的活性成分之一，對(duì)可興奮細(xì)胞及非可興奮細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流都有影響，主要通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等操縱的Ca2+內(nèi)流發(fā)揮藥理作用［9］。然而，三七皂苷R1對(duì)PH發(fā)病的治療作用是否與PASMCs膜上的SOCC有關(guān)，尚未見報(bào)道。

本研究分別采用CH和MCT兩種方法，建立PH大鼠模型，結(jié)果顯示兩種模型大鼠的 MRVP、RVSP和RVMI均明顯升高，提示兩種PH模型制備成功，同時(shí)，本研究旨在探討三七皂苷R1對(duì)PH大鼠PASMCs膜上SOCC的作用。Nif是L-VDCC的阻斷劑［3］，本研究在Nif預(yù)處理排出L-VDCC作用的前提下，采用激動(dòng)劑ET-1誘發(fā)正常大鼠PAs收縮，觀察三七皂苷R1對(duì)非電壓依賴性Ca2+通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流的阻斷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1能部分舒張ET-1誘發(fā)的PAs收縮，且呈劑量依賴性，該結(jié)果表明三七皂苷R1可能通過部分阻斷非電壓依賴性Ca2+通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，達(dá)到舒張肺血管作用。

為明確三七皂苷R1究竟是通過阻斷PAs上的何種非電壓依賴性Ca2+通道發(fā)揮舒張血管作用，本研究選擇Gd3+阻斷ET-1誘發(fā)PAs收縮。Gd3+為鑭系元素，對(duì)SOCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流有高度的選擇性，在很低濃度時(shí)即可以將其阻斷［10］。本部分研究在Nif阻斷L-VDCC的前提下，采用激動(dòng)劑ET-1誘發(fā)PAs收縮，再用Gd3+阻斷ET-1誘發(fā)的PH大鼠PAs收縮，在此基礎(chǔ)上觀察三七皂苷R1對(duì)PAs的進(jìn)一步舒張效應(yīng)。結(jié)果證實(shí)，在Gd3+阻斷PAs收縮后，三七皂苷R1對(duì)PAs無進(jìn)一步舒張效應(yīng)。提示三七皂苷R1對(duì)ET-1誘發(fā)PAs收縮的舒張效應(yīng)是由于部分阻斷了SOCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流引起的。

為進(jìn)一步證實(shí)R1通過部分抑制SOCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流舒張PAs，本實(shí)驗(yàn)觀察三七皂苷R1對(duì)CPA誘發(fā)PH大鼠PAs收縮的抑制作用。CPA是一種肌漿網(wǎng)Ca2+泵耗竭劑，可特異性觸發(fā)SOCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流［4－5，11－12］。因此，我們采用 SOCC 激動(dòng)劑CPA誘發(fā)PAs收縮，觀察三七皂苷R1對(duì)肺動(dòng)脈血管的舒張效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1能使CPA誘發(fā)的PAs收縮效應(yīng)部分舒張，而這種作用是通過部分抑制SOCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流引起的。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了三七皂苷R1可通過部分抑制SOCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流舒張PAs。

總之，三七皂苷R1可能通過阻斷鈣池操縱性鈣內(nèi)流介導(dǎo)的PAs收縮產(chǎn)生治療PH作用。

［1］ Simonneau G.A new clinical classification of pulmonary hypertension［J］.Bull Acad Natl Med，2009，193(8):1897 －909.

［2］ 張明芳，劉曉如，楊 娜.TRPC6介導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈張力和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ca2+濃度的升高［J］.生理學(xué)報(bào)，2010，62(1):55 －62.

［2］ Zhang M F，Liu X R，Yang N.TRPC6 mediates the enhancements of pulmonary arterial tone and intracellular Ca2+concentration of pulmonary arterial smooth muscle cells in pulmonary hypertension rats［J］.Acta Physiol Sin，2010，62(1):55 －62.

［3］ Humbert M，Morrell N W，Archer S L.Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertension［J］.J Am Coll Cardiol，2004，43(12 Suppl S):13S －24S.

［4］ Lin M J，Leung G P，Zhang W M.Chronic hypoxia-induced upregulation of store-operated and receptor-operated Ca2+channels in pulmonary arterial smooth muscle cells:a novel mechanism of hypoxic pulmonary hypertension［J］.Circ Res，2004，95(5):496－505.

［5］ Liu X R，Zhang M F，Yang N.Enhanced store-operated Ca2+entry and TRPC channel expression in pulmonary arteries of monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2012，302(1):C77 －87.

［6］ Wang J，Jiang Q，Wan L.Sodium tanshinone IIA sulfonate inhibits canonical transient receptor potential expression in pulmonary arterial smooth muscle from pulmonary hypertensive rats［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2013，48(1):125 －34.

［7］ Wang C Z，Xie J T，Zhang B.Chemopreventive effects of Panax notoginseng and its major constituents on SW480 human colorectal cancer cells［J］.Int J Oncol，2007，31(5):1149 －56.

［8］ Liu X R，Liu Q，Chen G Y.Down-regulation of TRPM8 in pulmonary arteries of pulmonary hypertensive rats［J］.Cell Physiol Biochem，2013，31(6):892－904.

［9］ Chen W X，Wang F，Liu Y Y.Effect of notoginsenoside R1 on hepatic microcirculation disturbance induced by gut ischemia and reperfusion［J］.World J Gastroenterol，2008，14(1):29 － 37.

［10］ Sun B，Xiao J，Sun X B.Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice:an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling［J］.Br J Pharmacol，2013，168(7):1758－70.

［11］林默君，關(guān)永源，賀 華.巰亞硝基卡托普利對(duì)環(huán)匹阿尼酸引起的平滑肌細(xì)胞胞漿游離Ca2+濃度升高作用的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001，17(6):632－7.

［11］ Lin M J，Guan Y Y，He H.Effect of S-nitrosocaptopril on cyclopiazonic acid-induced［Ca2+］ichange in rat aortic smooth muscle cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2001，17(6):632 －7.

［12］承 偉，李 智.肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣的改變［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(5):593－6.

［12］ Cheng W，Li Z.Alteration of［Ca2+］iin pulmonary artery smooth muscle of pulmonary artery hypertension rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(5):593 －6.