三七總皂苷對H9c2細(xì)胞P450酶mRNA表達(dá)的影響

胡東華，王宇光，陳志武，馬增春，梁乾德，肖成榮，譚洪玲，湯響林，高 月

三七總皂苷(panax notoginseng saponin，PNS)是五加科植物三七［Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen］的主要活性成分，其在三七中的含量高達(dá)12%。PNS中三七皂苷 R1、人參皂苷Rb1、Rg1、Rd和Re為其主要成分，約占總皂苷含量的80%［1］，具有防止脂質(zhì)在血管內(nèi)沉積，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，促纖溶及抑制血小板聚集，促進(jìn)微循環(huán)，抗動(dòng)脈粥樣硬化，保護(hù)心肌等作用［2－3］。是臨床用血栓通的主要成份，主要用于擴(kuò)張血管，改善血液循環(huán)。

細(xì)胞色素P450酶(CYP450)最初發(fā)現(xiàn)于肝臟中，其在生物轉(zhuǎn)化、藥物代謝、解毒等方面進(jìn)行廣泛深入的研究;近年來發(fā)現(xiàn)心臟中也含有CYP，并且以CYP2和CYP4家族為代表與心血管疾病密切相關(guān)的CYP亞型也成為研究熱點(diǎn)，內(nèi)源性物質(zhì)花生四烯酸(arachidonicacid，AA)經(jīng)P450酶途徑的代謝產(chǎn)物對心血管系統(tǒng)的影響近年來日益受到重視［4］。近年來許多CYP家族在心臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中得以鑒定，同時(shí)很多證據(jù)顯示內(nèi)源性物質(zhì)經(jīng)CYP的代謝產(chǎn)物在維持心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［5］。研究表明，花生四烯酸可被CYP環(huán)氧酶(CYP2C11，2J3)代謝為環(huán)氧二十碳三烯酸(EET)或被 CYP ω-羥化酶(CYP4A，4F)代謝為20-羥基二十碳四烯酸(20-HETE)［6］。

以往對于PNS的藥理機(jī)制研究主要集中在對心肌的保護(hù)作用、鈣拮抗作用、對抗心肌肥大、抑制心室重構(gòu)、抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、抗血栓形成和抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用、肝臟P450酶等方面［7－9］。目前尚未見 PNS對心臟細(xì)胞色素P450調(diào)控的研究，鑒于近年來發(fā)現(xiàn)心臟細(xì)胞色素P450在心血管系統(tǒng)中同樣執(zhí)行重要功能，PNS作為治療心腦血管疾病的臨床常用藥物，其對心肌細(xì)胞色素P450影響和機(jī)制仍不是十分清楚。本研究利用Real Time PCR方法從心臟P450酶的層面考察PNS處理心肌細(xì)胞H9c2，細(xì)胞色素P450亞型表達(dá)的變化，以評價(jià)PNS對心臟P450酶亞型是否有抑制或誘導(dǎo)效應(yīng)，為進(jìn)一步深入研究PNS以心臟P450為靶點(diǎn)的心血管藥理效應(yīng)的機(jī)制提供線索，同時(shí)為指導(dǎo)臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品 PNS［廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司］，依據(jù)國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS-10460-(ZD-0460)-2002-2011Z檢驗(yàn)合格;DMEM和血清(FBS)(Hyclone);胰酶(Sigma);MTS試劑盒(Promega);LDH試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司);PBS(北京凱欣杰生物技術(shù)有限公司);RNApure超純總RNA快速提取試劑盒(博邁德生物);Trans ScriptTMOne-Step RT-PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司);Fast SYBR@Green Master Mix(Applied Biosystems)，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(NAPCO 5410);超凈工作臺(北京長城空氣凈化設(shè)備公司);倒置顯微鏡(Nikon 120型);Victor X5酶標(biāo)儀(Perkin Elmer)PCR儀(Gene Amp 2400);核酸蛋白分析儀 (Beckman DU640);StepOne PlusTMReal Time PCR(Applied Biosystems)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織(購自北京協(xié)和細(xì)胞庫)，在37℃、5%CO2的條件下，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基中，融合率為80% ～90%時(shí)，按1∶3的比例傳代。

1.4 PNS 母液配制(200 g·L－1)［10］精確稱取2.000 g的PNS粉末，加入5 ml的去離子水，緩慢攪拌使其溶解，再加去離子水定容至10 ml，攪拌使其充分溶解;用0.22 μm孔徑的微孔濾器過濾除菌;分裝至1.5 ml EP管，4℃冰箱保存。

1.5 MTS法檢測H9c2細(xì)胞活性 用DMEM培養(yǎng)基將對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞以2×104個(gè)/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板(空白孔不種細(xì)胞)，200 μl/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng) 24 h;實(shí)驗(yàn)分為空白組，PNS組(濃度依次為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 g·L－1)和陰性對照組，培養(yǎng)48 h;每孔加MTS液8 μl，繼續(xù)孵育4 h;用酶標(biāo)儀測定490 nm處的光密度值(OD);按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(IC)/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值－空白組OD值)/(陰性對照組OD值－空白組OD值)×100%

1.6 乳酸脫氫酶比色法(LDH)檢測H9c2細(xì)胞損傷 對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞以2×104個(gè)/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板(空白孔不種細(xì)胞)，200 μl/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h;實(shí)驗(yàn)分組如上，培養(yǎng)48 h后，按照LDH試劑盒操作說明進(jìn)行試驗(yàn)，按以下公式計(jì)算細(xì)胞的損傷。

細(xì)胞LDH釋放率/%=細(xì)胞培養(yǎng)基中測定的酶活力單位/(細(xì)胞裂解液測定的酶活力單位+細(xì)胞培養(yǎng)基測定的酶活力單位)×100%

1.7 Real Time PCR測定H9c2細(xì)胞CYP450 mRNA水平影響 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組，PNS組(濃度依次為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5 g·L－1)接種 6孔板中，給藥48 h后取各處理組H9c2細(xì)胞，按試劑盒說明提取心肌細(xì)胞總RNA，電泳分析表明18S和28S條帶清晰可見，A260/A280比值在 1.7～2.0，總RNA片段完整未降解可用。取 2 μg RNA按照TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，42℃ 30 min;85℃ 5 min。用 ABI StepOne PlusTMReal Time PCR進(jìn)行 PCR反應(yīng)，取2.0 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，加入上下游引物 20 μmol· L－1各 0.5 μl，F(xiàn)ast SYBR@Green Master Mix 10 μl，補(bǔ)充 Rase-free water 至 20 μl。反應(yīng)參數(shù):95℃ 20 s預(yù)變性，95℃ 3 s變性，60℃ 30 s退火，共40個(gè)循環(huán)。每次擴(kuò)增設(shè)置β-actin內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量分析，用2－(△△Ct)方法分析。特異性引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers sequence used in Real Time PCR analy

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉ±s表示，采用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTS法檢測H9c2細(xì)胞活性 以PNS(濃度依次為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 g·L－1)處理H9c2細(xì)胞48 h以后，測定各處理組細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示隨著三七總皂苷濃度的升高，細(xì)胞的存活率逐漸下降。低濃度的PNS對細(xì)胞的存活率沒有影響(如0.3125、0.625 g·L－1)。用Origin8.0 軟件擬合計(jì)算IC50(5.28±0.08)g·L－1(Fig 1)。

2.2 乳酸脫氫酶比色法(LDH)檢測H9c2細(xì)胞損傷 對各處理組細(xì)胞的LDH進(jìn)行測定，結(jié)果顯示以PNS處理H9c2細(xì)胞48h后，隨著PNS濃度的升高，乳酸脫氫酶的釋放率逐漸增大，與空白組比較，5、10、20 g·L－1組的 LDH 釋放率明顯增高(P＜0.01)，而 0.3125、0.625、1.25 g·L－1組的 LDH 釋放率沒有變化(Fig 2)。

Fig 1Effect of PNS on cell viability of H9c2 cells(ˉ±s，n=5)

Fig 2Effect of PNS on LDH release rate of H9c2 cells(ˉ±s，n=5)

2.3 PNS對H9c2細(xì)胞P450酶 mRNA表達(dá)的影響

2.3.1 PNS對 H9c2細(xì)胞 CYP2C11和 CYP2J3亞型mRNA水平的影響 PNS對H9c2細(xì)胞CYP450酶Ⅱ家族mRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示，與空白組比較，PNS對CYP2C11有下調(diào)趨勢(P＜0.05或P＜0.01)，而對CYP2J3有上調(diào)作用，且作用比較明顯(P＜0.01)。

2.3.2 PNS對 H9c2細(xì)胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4A3、CYP4F1、CYP4F4 和 CYP4F5 亞型mRNA水平的影響 如Fig 4所示，PNS對H9c2細(xì)胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4F1和CYP4F5有上調(diào)趨勢(P＜0.01)，并且有一定的濃度依賴性。PNS對CYP4A3和CYP4F4，在低濃度時(shí)有下調(diào)作用(P＜0.05或P＜0.01)，而在最大濃度時(shí)，對這兩個(gè)亞型有一定的上調(diào)作用(P＜0.01)。

3 討論

Fig 3Effect of PNS on CYP2C11 and CYP2J3 gene expression of H9c2 cellsˉ±s，n=3)

細(xì)胞色素P450(CYPs)酶是混合功能氧化酶系，多表達(dá)于肝臟，人體內(nèi)約有75%的藥物通過CYP450代謝［11］。EETs具有抗炎，抑制平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，調(diào)節(jié)血管張力，促纖溶，抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，在心腦血管中有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，主要有CYP2C11和 CYP2J3參與［12］。20-HETE在大鼠中主要由CYP450酶4家族代謝，這是一種強(qiáng)有力的縮血管物質(zhì)，對血壓調(diào)節(jié)有重要影響，主要有CYP4A和4F參與［13］。因此本文從心臟的主要藥物代謝酶為研究對象，研究PNS對上述CYP亞型表達(dá)的影響，旨在探討PNS對心血管藥理作用新的可能機(jī)制。

Fig 4Effect of PNS on CYP4A1，CYP4A2，CYP4A3，CYP4F1，CYP4F4 and CYP4F5 gene expression of H9c2 cells(ˉ±s，n=3)

MTS的測定結(jié)果可以反映細(xì)胞的存活程度。細(xì)胞受到損傷時(shí)，激活一系列的酶促反應(yīng)造成細(xì)胞內(nèi)LDH大量外釋，并且誘導(dǎo)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。通過PNS處理H9c2細(xì)胞48 h后，MTS結(jié)果表明隨著PNS濃度的增大，細(xì)胞的存活率逐漸降低，并且呈濃度依賴性，低濃度對細(xì)胞的存活率沒有影響(如 0.3125、0.625 g·L－1);LDH 的釋放率隨著濃度的升高而逐漸增大，0.3125、0.625、1.25 g·L－1組的LDH釋放率沒有變化。提示PNS在高濃度時(shí)可能會(huì)對細(xì)胞有一定的損傷。PNS對大鼠腎小球系膜細(xì)胞有一定的抑制作用，并呈劑量依賴性［14］。有研究顯示PNS在治療劑量下對肝臟損傷有保護(hù)作用，大劑量(150 mg·kg－1)對大鼠有肝腎毒性，在150 mg·kg－1以上時(shí)對心臟功能具有毒性效應(yīng)［15－16］。結(jié)合本次研究結(jié)果，提示臨床應(yīng)用此類藥物時(shí)應(yīng)注意劑量。

CYP2J2/3主要表達(dá)于心臟，且主要合成具有心臟保護(hù)作用的EETs，而EETs有擴(kuò)張血管的作用。大鼠心臟CYP2J3與人類心臟CYP2J2具有70%的同源性。Bhatnagar［17］研究發(fā)現(xiàn) CYP2J對心臟表現(xiàn)為保護(hù)作用，而CYP2C則表現(xiàn)為加重?fù)p傷，提出CYP450不同亞型可能因產(chǎn)生氧自由基不同，而表現(xiàn)為加重或拮抗心肌缺血/再灌注損傷。PNS各濃度對CYP2C11有下調(diào)趨勢，而對CYP2J3有上調(diào)作用，提示PNS有一定的保護(hù)心臟，擴(kuò)張血管的作用。CYP450酶4家族羥化酶代謝花生四烯酸產(chǎn)生20-HETE，這是一種強(qiáng)有力的縮血管物質(zhì)。PNS各濃度對 H9c2細(xì)胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4F1和CYP4F5有上調(diào)趨勢，而對 CYP4A3和CYP4F4在低濃度時(shí)有下調(diào)作用，而在最大濃度時(shí)(5 g·L－1)，對這兩個(gè)亞型有一定的上調(diào)作用，這可能是高濃度對細(xì)胞的影響的結(jié)果。

PNS作為臨床用血栓通的主要成份，本研究結(jié)果顯示高濃度的PNS可能會(huì)有一定的毒性。同時(shí)PNS對CYP450酶不同的亞型有不同程度的誘導(dǎo)或者抑制作用，提示PNS對心臟和血管有一定的保護(hù)作用。因此使用PNS時(shí)應(yīng)注意用藥劑量，使其發(fā)揮療效而盡量減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)在臨床應(yīng)用時(shí)注意用藥劑量。

［1］ Li X Y，Wang G G，Sun J G，et al.Pharmacokinetic and absolute bioavailability study of total panax notoginsen-oside，a typical multiple constituent traditional Chinese medicine(TCM)inrats［J］.Biol Pharm Bull，2007，30(5):847 －51.

［2］ 李曉宇，孫建國，鄭媛婷，等.三七總皂苷對抗H2O2所致大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(8):1030－4.

［2］ Li X Y，Sun J G，Zheng Y T，et al.Protective effect study of major constituent in total panax notoginsenoside on rat brain microvessel endothelial cell(RBMEC)damage induced by H2O2［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(8):1030 －4.

［3］ 吳 穎，孫 冰，肖 靜，等.三七皂苷R1對LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(2)179－84.

［3］ Wu Y，Sun B，Xiao J，et al.Protective effect of Notoginesenoside R1 on lipopolysaccharide-induced myocardial dysfunction in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(2):179 －84.

［4］ Roman R J.P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function［J］.Physiol Rev，2002，82:131 －85.

［5］ Elbekai R H，El-Kadi A O.Cytochrome P450 enzymes:central players in cardiovascular health and disease［J］.Pharmacol Ther，2006，112:564－87.

［6］ Roman R J.P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function［J］.Physiol Rev，2002，82:131 －85.

［7］ 沈 央，方曉玲.三七總皂苷脂質(zhì)體的生理適應(yīng)性及其對心腦血管的保護(hù)作用［J］.中國臨床藥學(xué)雜志，2004，13(5):269－73.

［7］ Shen Y，F(xiàn)ang X L.Panax notoginseng liposomes:physiological compatibility and effects on cardio-cerebrovascular diseases study［J］.Chin J Clin Pharmacy，2004，13(5):269 －73.

［8］ Nah S Y，Park H J，McCleskey E W.A trace component of ginseng that inhibit Ca2+channels through a pertussis toxin sensitive G protein［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(19):8739 －43.

［9］ 李曉宇，劉皋林，周佳純，等.三七總皂苷注射液對大鼠肝CYP450酶的影響［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009，14(8):849－54.

［9］ Li X Y，Liu G L，Zhou J C，et al.Experimental study on the effects of liver cytochrome protein 450(CYP450)induced by panax notoginsenoside injection in rats［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，2009，14(8):849 －54.

［10］陳少賢，楊 敏.三七總皂苷抗缺血誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究［D］.中國碩士論文數(shù)據(jù)庫，2010:1－75.

［10］ Chen S X，Yang M.Study of the anti-apoptotic effect and mechanism of panax notoginseng saponin on rat cardiomyocytes induced by ischemia［D］.China’s Master’s Dissertaion Database，2010:1－75.

［11］ Larsen B T，Gutterman D D，Hatoum OA.Emerging role of epoxyeicosa-trienoic acids in coronary vascular function［J］.Eur J Clin Invest，2006，36:293 －300.

［12］ Sun J，Sui X，Bradbury J A，et al.Inhibition of vascular smooth muscle cell migration by cytochrome p450 epoxygenase-derived eicosanoids［J］.Circ Res，2002，90:1020 － 7.

［13］ Zou A P，F(xiàn)leming J T，F(xiàn)alck J R，et al.20-HETE is an endogenous inhibitor of the large-conductance Ca2+-activated K+channel in renal arterioles［J］.Am J Physiol，1996，270:228 －37.

［14］趙 湘，邱蓮女，郭俊華，等.三七總皂苷對大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(2):287－9.

［14］ Zhao X，Qiu L N，Gou J H，et al.The effect of total Panax Notoginseng Saponins in regulating the cell proliferation and cell cycle in rat’s mesangial cells［J］.Chin Arch Tradit Chin Med，2008，26(2):287－9.

［15］韓 剛，孫輝業(yè)，董延生，等.三七總皂苷對大鼠肝臟腎臟的毒性作用［J］.中國新藥雜志，2006，15(24):2115－8.

［15］ Han G，Sun H Y，Dong Y S，et al.Rat’hepatic and renal toxicity of total saponins from panax notoginseng［J］.Chin J New Drugs，2006，15(24):2115－8.

［16］徐 江，彭雙清，閆長會(huì)，等.三七總皂苷對大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)的毒性作用［J］.中國新藥雜志，2009，18(4):345－52.

［16］ Xu J，Peng S Q，Yan C H，et al.Toxice ffects of Panax notoginseng saponins on cardiachemodynamics in rats［J］.Chin J New Drugs，2009，18(4):345 －52.

［17］ Bhatnagar A.Beating ischemia:a new feat of EETs［J］?Circ Res，2004，95(5):443 －5.