去甲腎上腺素對(duì)嗎啡依賴大鼠中樞痛覺的調(diào)制

石鐵鋒，楊春曉，楊東曉，閆彬彬，許 艷，張 輝，張 穎，徐滿英

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)1.附屬第二醫(yī)院、2.生理學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

阿片類藥物依賴已成當(dāng)今世界的重要社會(huì)問題之一，不僅危害人類的身心健康和家庭幸福，而且還嚴(yán)重地干擾了社會(huì)安寧和生產(chǎn)發(fā)展。嗎啡依賴是一種頑固的、慢性復(fù)發(fā)性腦?。?］，是多個(gè)腦區(qū)、多種神經(jīng)遞質(zhì)參與的復(fù)雜的一系列神經(jīng)系統(tǒng)適應(yīng)性改變。動(dòng)物在嗎啡依賴過程中，腦內(nèi)腎上腺素能等神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生一定變化，這些變化可能與嗎啡成癮的產(chǎn)生有密切關(guān)系。

在大鼠腦內(nèi)，去甲腎上腺素(NE)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。NE參與許多腦功能，包括覺醒、注意力、情緒、學(xué)習(xí)、記憶和應(yīng)激反應(yīng)［2］。NE對(duì)疼痛的影響是復(fù)雜的。NE對(duì)疼痛的作用取決于其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異位點(diǎn)，NE能受體亞型的分布，病理性疼痛狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間和當(dāng)時(shí)的情況。NE和其他化學(xué)物質(zhì)在下行抑制系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用。NE可抑制C纖維傳導(dǎo)周圍傷害性刺激信息到脊髓側(cè)角［3］。

伏核(NAc)是位于邊緣系統(tǒng)和基底神經(jīng)節(jié)交界處的一個(gè)較大的核團(tuán)。NAc接受大腦不同區(qū)域的各種神經(jīng)纖維的投射，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的多種功能，如藥物成癮、行為、學(xué)習(xí)、運(yùn)動(dòng)和心血管活動(dòng)等。NAc還含有豐富的內(nèi)源性阿片肽，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛傳送和調(diào)制中起著重要作用。NAc內(nèi)的阿片肽和膽囊收縮素相互作用可以調(diào)節(jié)疼痛。來自中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)神經(jīng)纖維上行投射到NAc和NAc神經(jīng)纖維下行投射到PAG，它們均參與鎮(zhèn)痛作用。我們研究室已證明［4］，谷氨酸、地卓西平馬來酸鹽和N-甲基-D-天冬氨酸受體參與NAc內(nèi)傷害性信息傳送的調(diào)制。近年來，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)在NAc內(nèi)存在NE，并表明它在疼痛調(diào)節(jié)中起著重要作用［5］。但是，NE和酚妥拉明對(duì)嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)PENs和PINs的痛誘發(fā)電活動(dòng)的影響尚不清楚。因此，本研究使用細(xì)胞外的電生理記錄技術(shù)，探討NE和酚妥拉明對(duì)嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)PENs和PINs的痛誘發(fā)電活動(dòng)的影響，以便揭示NE和NAc在嗎啡依賴大鼠中樞痛覺生產(chǎn)和調(diào)制的作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用成年、健康Wistar大鼠，清潔級(jí)，♀♂不拘，體質(zhì)量為220～250 g(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物中心提供，級(jí)別:Ⅱ，許可證號(hào):黑20020002)。

1.2 方法 大鼠在注射鹽酸嗎啡前，記錄30 min的行為變化。然后，大鼠按逐日遞增劑量的原則，背部皮下注射鹽酸嗎啡，連續(xù)給藥6 d，每日藥量依次為:5、10、20、40、50、60 mg·kg－1，3 次 .d－1(8 ∶00，12 ∶00，16 ∶00)，建立嗎啡成癮大鼠的模型［6－7］。

將60只嗎啡依賴大鼠隨機(jī)地分為3組:(1)生理鹽水組(20只):NAc內(nèi)注射生理鹽水0.5 μl;(2)NE 組(20 只):NAc內(nèi)注射 NE(4 g·L－1，0.5 μl);(3)酚妥拉明組(20只):NAc內(nèi)注射酚妥拉明(4 g·L－1，0.5 μl);給每種藥的時(shí)間均為2 min。d 7 早8∶00觀察大鼠的自然戒斷癥狀后，開始實(shí)驗(yàn)。嗎啡依賴大鼠用200 g·L－1氨基甲酸乙酯(5 ml·kg－1，北京化工廠)腹腔注射麻醉和 50 g·L－1利多卡因必要時(shí)創(chuàng)口補(bǔ)充麻醉下實(shí)施常規(guī)手術(shù)，即氣管插管、顱骨開窗、挑開小腦延髓池處的硬腦膜引流腦脊液和分離坐骨神經(jīng)。術(shù)后，將大鼠頭部固定在SN-2腦立體定位儀(Narishige，Japan)上。大鼠腹腔注射溫生理鹽水5 ml補(bǔ)液，熱水袋保暖，維持肛溫37℃ ～38℃。根據(jù) Pellegrino圖譜 B座標(biāo)系統(tǒng)［8］，對(duì)NAc進(jìn)行定位:A:3.2～4.0 mm;R 或 L:1.0～1.8 mm;H:6.2～7.0 mm。然后進(jìn)行人工呼吸，并大鼠腹腔注射1 g·L－1氯化筒箭毒堿 (1 ml·kg－1)制動(dòng)，以松弛肌肉排除肌細(xì)胞電活動(dòng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響。將帶保護(hù)的兩根銀絲刺激電極平行鉤在坐骨神經(jīng)上，松緊適宜，用液體石蠟浸沒神經(jīng)。SEN-3301型電子刺激器(Nihon Konden，Japan)發(fā)出的串脈沖(延遲:0 ms，間隔:5 ms，強(qiáng)度:5 mA，持續(xù)時(shí)間:0.3 ms，脈沖:5個(gè))刺激大鼠坐骨神經(jīng)，作為傷害性痛刺激。關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)和毛發(fā)觸摸被用作非傷害性刺激，以確定疼痛相關(guān)的神經(jīng)元。將內(nèi)充3 mol·L－1氯化鉀溶液，直流電阻為10～30 MΩ的玻璃微電極固定在SM-21型微電極操縱器(Narishige，Japan)上，并插入NAc內(nèi)引導(dǎo)痛反應(yīng)神經(jīng)元的放電。根據(jù)Pellegrino圖譜B座標(biāo)系統(tǒng)［8］，將內(nèi)充生理鹽水或NE、酚妥拉明的玻璃微電極固定在SM-11型微電極操縱器(Narishige，Japan)上，并插入NAc(A:3.6 mm;R或L:1.6 mm;H:6.2 mm)內(nèi)，然后用ZCZ-50型自動(dòng)抽注儀分別向NAc內(nèi)勻速注入0.5 μl的生理鹽水或 NE(4 g·L－1，0.5 μl)、酚妥拉明(4 g·L－1，0.5 μl)，給藥時(shí)間均為 2 min。觀察注藥前、后痛反應(yīng)神經(jīng)元電活動(dòng)的變化，電信號(hào)經(jīng)JSD-731-F前級(jí)放大器(信號(hào)的高頻過濾器:3 kHz，低頻率濾波器:0.01 s，放大倍數(shù):100-fold)放大，顯示于VC-9示波器(Nihon Konden，Japan)監(jiān)視，并用ST-CH707X型雙道磁帶錄音機(jī)記錄痛反應(yīng)神經(jīng)元的電變化。每個(gè)痛反應(yīng)神經(jīng)元的放電記錄3次，每2 min 1次，連續(xù)觀察30 min。

1.3 神經(jīng)元的定義 在NAc記錄的神經(jīng)元分為3種類型:(1)無關(guān)神經(jīng)元:對(duì)傷害性刺激或非傷害性刺激均沒有反應(yīng);(2)會(huì)聚神經(jīng)元:對(duì)傷害性刺激和非傷害性刺激均有反應(yīng);(3)痛反應(yīng)神經(jīng)元:只對(duì)傷害性刺激有反應(yīng)。痛反應(yīng)神經(jīng)元可分為痛興奮神經(jīng)元(PENs)和痛抑制神經(jīng)元(PINs)。PENs的定義是指對(duì)傷害性刺激增加其放電頻率反應(yīng)的神經(jīng)元;而PINs的定義是指對(duì)傷害性刺激降低其放電頻率反應(yīng)的神經(jīng)元。該研究主要是觀察和記錄PENs和PINs的電活動(dòng)。

1.4 觀察指標(biāo) 凈增值(NIV，Hz)，是指 PEN或PIN在傷害性刺激前2 s內(nèi)放電平均頻率和傷害性刺激后誘發(fā)放電平均頻率之間差值。潛伏期(s)是指從傷害性刺激起到出現(xiàn)PEN放電的時(shí)間。抑制時(shí)程(ID，s)是指從傷害性刺激起到出現(xiàn)PIN放電之間的持續(xù)時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Powerlab/8 s(ADInstruments)數(shù)據(jù)處理儀處理后輸入計(jì)算機(jī)，用Chart v 5.3軟件(Australian)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示和用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)差異用重復(fù)測(cè)量方差分析和F檢驗(yàn)。兩組間差異顯著性用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 生理鹽水對(duì)嗎啡依賴大鼠NAc痛反應(yīng)神經(jīng)元痛誘發(fā)電活動(dòng)的影響 在生理鹽水組，NAc內(nèi)給予正常生理鹽水，嗎啡依賴大鼠的26 PENs或20 PINs的痛誘發(fā)電活動(dòng)沒有明顯變化(Fig 1a和Fig 2a)。

2.2 NE對(duì)嗎啡依賴大鼠NAc痛反應(yīng)神經(jīng)元痛誘發(fā)電活動(dòng)的影響 在NE組，24 PENs的平均潛伏期是(0.15±0.03)s，而平均 NIV是(5.53±0.12)Hz。NAc內(nèi)注射NE后立刻，PENs的潛伏期開始增加，NIV開始下降(Fig 1b)。在給NE后8 min，這些作用達(dá)到高峰，即平均潛伏期為(0.69±0.02)s(F=3.174，P＜0.0001)，NIV 為(1.28±0.09)Hz(F=2.458，P＜0.0001)。在給 NE后0～16 min期間，PENs的平均潛伏期(F=60.167，P＜0.0001)和NIV(F=3.681，P＜0.0001)分別與生理鹽水組同期相比差異有顯著性(Fig 3)。在給NE 20 min后，PENs的潛伏期和NIV開始逐漸恢復(fù)。

18 PINs的平均ID是(1.70±0.04)s，而 NIV是(－2.68±0.12)Hz。NAc內(nèi)注射NE后，PINs的ID開始縮短，并NIV開始增加(Fig 2b)。在給NE后8 min，這些作用達(dá)到高峰，即平均 ID下降到(0.44±0.02)s(F=2.904，P＜0.0001)，而 NIV 增加到(－0.21±0.03)Hz(F=66.150，P＜0.0001)。在注射后的4～16 min，平均 ID(F=9.126，P＜0.0001)和NIV(F=1.455，P＜0.0001)出現(xiàn)了明顯變化與生理鹽水組同期相比(Fig 4)。

2.3 酚妥拉明對(duì)嗎啡依賴大鼠NAc痛反應(yīng)神經(jīng)元痛誘發(fā)電活動(dòng)的影響 在酚妥拉明組，22PENs的平均潛伏期為(0.16±0.02)s，而NIV為(5.13±0.14)Hz。NAc內(nèi)給予酚妥拉明后，PENs的潛伏期開始縮短，而NIV開始增加(Fig 1c)。這些效應(yīng)在給藥后8 min達(dá)到高峰，平均潛伏期下降到(0.01±0.03)s(F=138.889，P＜0.0001)，而 NIV 增加到(9.77±0.18)Hz(F=1.432，P＜0.0001)。在給藥后4～12 min期間，PENs的平均潛伏期(F=5.596，P=0.031)和 NIV(F=3.138，P＜0.0001)分別與生理鹽水組同期相比差異有顯著性(Fig 3)。

Fig 1 Effects of intra-NAc microinjection of normal saline(a)or NE(b)，phentolamine(c)on the evoked discharges of PEN in the NAc of morphine-dependent rats

17 PINs的平均 ID為(1.68±0.05)s，而 NIV為(－2.78±0.09)Hz。在注射酚妥拉明后，ID開始延長，而NIV開始減少(Fig 2c)。在給予酚妥拉明后8 min，PINs的平均ID增加到(4.07±0.02)s(F=2.485，P＜0.0001)，而NIV下降到(－4.80±0.13)Hz(F=3.456，P＜0.0001)。在給藥后0～16 min期間，PINs的平均 ID(F=5.675，P＜0.0001)和NIV(F=1.955，P＜0.0001)分別與生理鹽水組同期相比有明顯差異(Fig 4)。在給予酚妥拉明后20 min，PINs的平均ID和NIV開始恢復(fù)。

Fig 3 Influences of intra-NAc microinjection of different substances on the latency(a)and NIV(b)of PENs in the NAc of morphine-dependent rats

3 討論

本研究觀察了NE和酚妥拉明對(duì)嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)PENs和PINs生物電活動(dòng)的影響。該結(jié)果揭示，NAc內(nèi)給予NE可抑制PENs的電活動(dòng)，而增強(qiáng)PINs的電活動(dòng);而酚妥拉明能增強(qiáng)PENs的電活動(dòng)和抑制PINs的電活動(dòng)?？梢?，酚妥拉明和NE兩者之間在嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)的作用是對(duì)立的。結(jié)果表明，NE參與嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)傷害性信息傳送的調(diào)制。此外，PENs和PINs可以被認(rèn)為是疼痛研究的指標(biāo)［9］。PENs和PINs對(duì)相同的物質(zhì)具有相反的反應(yīng)，這也許可以解釋NE和酚妥拉明對(duì)疼痛的調(diào)制作用。

Fig 4 Influences of intra-NAc microinjection of different substances on the ID(a)and NIV(b)of PINs in the NAc of morphine-dependent rats

NE是一種單胺神經(jīng)遞質(zhì)，其對(duì)中樞痛覺調(diào)節(jié)作用相當(dāng)復(fù)雜。我們研究室曾證明，尾核內(nèi)注射NE可增加嗎啡依賴大鼠尾核內(nèi)PEN的電活動(dòng)，降低PIN的電活動(dòng)，即出現(xiàn)了NE易化疼痛效應(yīng)［10］。但側(cè)腦室注射NE能抑制嗎啡依賴大鼠核束旁的PEN電活動(dòng)，加強(qiáng)PIN電活動(dòng)，即表現(xiàn)出NE的鎮(zhèn)痛作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NAc內(nèi)注射NE也能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果。由于NE廣泛地分布在大腦中。許多腦結(jié)構(gòu)會(huì)聚于腦干組成了下行抑制系統(tǒng)，可調(diào)節(jié)脊髓痛覺的傳遞。NE、5-羥色胺(5-HT)等在下行抑制系統(tǒng)中起著重要的作用。NE能抑制外周C纖維傳送傷害性刺激信息到脊髓側(cè)角［3］。NE再攝取抑制劑，從而減輕初期由傷害性刺激引起的疼痛感覺［11］。單胺類，包括 NE、多巴胺(DA)，5 － HT 等，通過不同的神經(jīng)遞質(zhì)受體亞型調(diào)節(jié)背角神經(jīng)元的興奮性和傷害性疼痛［12］。NE在基礎(chǔ)條件下對(duì)痛覺影響不大，但長期疼痛可通過負(fù)反饋促進(jìn)NE介導(dǎo)抑制疼痛［13］。NE和5-HT通過在大腦和脊髓中的下行抑制途徑參與痛覺調(diào)制［14］。揭示，NE能系統(tǒng)和痛覺調(diào)制系統(tǒng)之間有著密切的關(guān)系。

NAc位于尾狀核吻側(cè)下方，視神經(jīng)管頂部。NAc接收來自谷氨酸能、5-HT能和NE能神經(jīng)元的投射。NAc中含有大量的內(nèi)源性阿片肽，在控制疼痛的傳送和調(diào)制起著重要的作用。NAc可通過阿片肽和膽囊收縮素之間的相互作用來調(diào)制疼痛。大量證據(jù)表明［15］，DA與NE由額葉前皮質(zhì)NE能的末稍共同釋放的。NAc的主要神經(jīng)遞質(zhì)是DA和NE，研究已證實(shí)在NAc內(nèi)，NE和DA神經(jīng)遞質(zhì)的水平是相等的?？梢?，NAc是中樞痛覺調(diào)制系統(tǒng)中重要核團(tuán)之一。

該系列結(jié)果揭示，NAc內(nèi)給予NE不僅可抑制嗎啡依賴大鼠NAc內(nèi)PEN的電活動(dòng)，還能加強(qiáng)PIN的電活動(dòng)，呈現(xiàn)出NE的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。當(dāng)NAc內(nèi)給予α-受體拮抗劑酚妥拉明時(shí)，NAc內(nèi)PEN的電活動(dòng)加強(qiáng)，而PIN的電活動(dòng)減弱，表現(xiàn)出酚妥拉明易化疼痛效應(yīng)。提示，NE或酚妥拉明是通過α-受體介導(dǎo)改變了NAc內(nèi)PEN和PIN的電活動(dòng)來調(diào)控中樞痛覺的。

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