PI3K/Akt信號通路在硫化氫保護(hù)PC12細(xì)胞對抗化學(xué)性缺氧損傷的作用

孟金蘭，陳雅嘉，陳 紅，董艷芬，邢德剛，梁燕玲，蘭愛平，馮鑒強(qiáng)

(1.廣東藥學(xué)院生理學(xué)系，廣東廣州 510006;2.廣州醫(yī)學(xué)院荔灣醫(yī)院體檢科，廣東 廣州 510170;3.廣州市

越秀區(qū)六榕街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心藥劑科，廣東廣州 510180;4.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理教研室，廣東廣州 510080)

磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)可以磷酸化肌醇磷脂肌醇環(huán)上的3’-OH，其家族包括許多脂質(zhì)激酶。Akt是原癌基因cakt的表達(dá)產(chǎn)物，它參與生長因子激活的經(jīng)PI3K介導(dǎo)的信號過程，是神經(jīng)元存活、神經(jīng)和血管新生、軸突以及樹突形成、突觸結(jié)構(gòu)形成和突觸間信息傳遞所必需［1－2］。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有調(diào)控物質(zhì)代謝、基因表達(dá)、細(xì)胞遷移、增殖和存活等多種生物學(xué)功能，也是神經(jīng)元存活的主要途徑之一。當(dāng)PI3K/Akt通路激活后不僅可以保護(hù)在體鼠腦缺氧缺血損傷［3］，而且也可抑制氧和糖剝奪誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡［4］。由此看來，PI3K/Akt信號通路的激活對于保護(hù)神經(jīng)元抗缺氧-缺血損傷尤為重要。

近年，本課題組［5－6］及其他學(xué)者［7］證實(shí) H2S 具有神經(jīng)保護(hù)作用，此作用機(jī)制可能與H2S的抗氧化作用，上調(diào)熱休克蛋白90(Hsp90)及抑制p38MAPK(絲裂原蛋白激酶)等有關(guān)［5－7］。然而，H2S能否激活神經(jīng)細(xì)胞PI3K/Akt信號通路?若可以，激活的PI3K/Akt途徑是否介導(dǎo)H2S的神經(jīng)保護(hù)作用?以上問題均未明了。

為此，本文應(yīng)用化學(xué)性低氧模擬劑CoCl2損傷來源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞(其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能特性與神經(jīng)元相似)，給予 H2S供體NaHS預(yù)處理建立抗化學(xué)性缺氧損傷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)模型［6］。擬著重探討:(1)H2S預(yù)處理能否激活PC12細(xì)胞PI3K/Akt信號通路;(2)PI3K/Akt信號通路是否介導(dǎo)NaHS預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用，為進(jìn)一步揭示新型氣體分子H2S的神經(jīng)保護(hù)作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及防治缺氧缺血性腦病拓展新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 NaHS、CoCl2、Ly294002購自美國 Sigma-Aldrich公司;CCK-8試劑盒購自日本 Dojindo Lab;DMEM培養(yǎng)基購自 Gibico公司;Akt、p-Akt抗體購自CST公司。PC12細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1 探討 NaHS干預(yù) PC12細(xì)胞對 Akt磷酸化(P-Akt)水平的影響 實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)NaHS干預(yù)濃度將 PC12 細(xì)胞分為 0、50、100、200、400、800 μmol·L－16組，每組均干預(yù)30 min，分別檢測NaHS對PC12細(xì)胞P-Akt水平的影響。

1.3.2 探討 PI3K/Akt通路抑制劑 Ly294002對H2S神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的影響 實(shí)驗(yàn)分組:(1)空白對照組(Control);(2)單獨(dú)NaHS組(NaHS):單獨(dú)應(yīng)用 400 μmol·L－1NaHS處理 PC12 細(xì)胞 30 min。(3)CoCl2損傷組(CoCl2):應(yīng)用 600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12細(xì)胞;(4)NaHS+CoCl2組:在CoCl2處理前30 min 加入400 μmol·L－1NaHS;(5)Ly294002+NaHS+CoCl2:在應(yīng)用 NaHS前用15 μmol·L－1Ly294002 處理細(xì)胞 30 min，其余的實(shí)驗(yàn)步驟與(4)組相同;(6)單獨(dú) Ly294002組(Ly294002):應(yīng)用 15μmol· L－1Ly294002 處理PC12細(xì)胞30 min。檢測各組細(xì)胞p-Akt的表達(dá)及存活率的改變。

1.4 細(xì)胞存活率的檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜后，更換為含有不同處理因素的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個復(fù)孔。處理結(jié)束后各組細(xì)胞分別加入CCK-8(每孔100 μl加10 μl CCK-8)37℃孵育4 h，隨后在酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔的吸收值(λ=450 nm)，按公式:存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD－空白對照組OD)/(正常對照組OD－空白對照組OD)×100%，求出實(shí)驗(yàn)組的存活率，重復(fù)3次。

1.5 PI染色流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求給以不同的因素處理后，離心收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。用PBS洗2遍，PI染色后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的含量(激發(fā)波長:488 nm;發(fā)射波長:610 nm)。每樣本計(jì)數(shù)12 000個細(xì)胞，以DNA組方圖中低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細(xì)胞數(shù)的多少。

1.6 Western blot法檢測p-Akt的水平 離心收集細(xì)胞。預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入裂解緩沖液，4℃靜置30 min。12 000×g離心10 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。隨后加入p-Akt抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入相應(yīng)的二抗(羊抗兔IgG)，孵育1 h，漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色后，用ImageJ 1.410進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，統(tǒng)計(jì)方法采用One-way ANOVA。

2 結(jié)果

2.1 NaHS對PC12細(xì)胞p-Akt水平的影響 應(yīng)用不同濃度(50、100、200、400、800 μmol·L－1)NaHS干預(yù) PC12細(xì)胞 30 min，觀察 p-Akt表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，在 50 ～ 400 μmol·L－1濃度范圍內(nèi)，呈濃度依賴性地上調(diào)p-Akt的水平，尤以400 μmol·L－1NaHS 干預(yù)時表達(dá)最高，為正常表達(dá)的2.7倍(Fig 1 A，B)(P＜0.01)，但當(dāng)NaHS濃度為 800 μmol·L－1時，p-Akt水平盡管明顯多于正常對照組(P＜0.01)，但比400 μmol·L－1組的明顯減少(P＜0.01)。上述濃度的NaHS對總Akt水平無明顯影響。

Fig 1 Effect of NaHS at different concentrations on the expression of Akt(±s，n=3)

2.2 PI3K介導(dǎo)了NaHS預(yù)處理誘導(dǎo)的Akt活化除受 PI3K激活外，Akt也受其它第二信使如Ca2+、cAMP的調(diào)節(jié)［8］。為了揭示 NaHS誘導(dǎo)的 Akt活化是否通過PI3K途徑介導(dǎo)?我們在NaHS預(yù)處理前使用PI3K抑制劑Ly294002，檢測其對p-Akt水平的影響。結(jié)果顯示Ly294002抑制了NaHS預(yù)處理對p-Akt的上調(diào)作用(Fig 2)，提示PI3K通路參與NaHS預(yù)處理對PC12細(xì)胞Akt的活化。

2.3 PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)H2S抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用 為了探討PI3K/Akt途徑在NaHS預(yù)處理抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，在NaHS預(yù)處理前 30 min，給予 PI3K抑制劑 Ly294002(15 μmol·L－1)作用于 PC12細(xì)胞，觀察 Ly294002能否拮抗NaHS預(yù)處理對細(xì)胞毒性的抑制作用。結(jié)果顯示，NaHS預(yù)處理可以保護(hù)PC12細(xì)胞對抗600 μmol·L－1CoCl2引起的細(xì)胞毒性，能使細(xì)胞存活率從(55.90±3.5)%升高至(77.78±3.4)%(P＜0.01)。而在預(yù)處理前使用15μmol·L－1Ly294002，使 PC12細(xì)胞的存活率從(77.78±3.4)%降低至(56.20±3.6)%(P＜0.01)。400 μmol·L－1NaHS 及15 μmol·L－1Ly294002 本身并不影響PC12細(xì)胞的存活率。結(jié)果提示PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)了H2S抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。

Fig 2 PI3K mediates activation of、Akt induced by NaHS preconditioning(n=3)

2.4 PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)H2S抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用 細(xì)胞凋亡時，由于DNA斷裂，在細(xì)胞DNA分布圖上的G1峰前可出現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡細(xì)胞所形成的凋亡峰。用流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果如Fig 4所示:PC12細(xì)胞經(jīng)400 μmol/L NaHS 預(yù)處理后，可使 600 μmol/L CoCl2引起的細(xì)胞凋亡率由(35.7±1.1)%下降至(18.3±2.5)%(P＜0.01)，而預(yù)處理前使用Ly294002，細(xì)胞的凋亡率從由(18.3±2.5)%上升為(34.0±2.5)%(P＜0.01)，NaHS和 Ly294002本身沒有誘導(dǎo)凋亡的作用(Fig 4)。

Fig 3 Effect of Ly294002 on increasing of cell viability induced by NaHS preconditioning(±s，n=5)

Fig 4 Influence of Ly294002 on anti-apoptosis induced by NaHS preconditioning(±s，n=3)

3 討論

最近，本課題組證實(shí)，H2S預(yù)處理能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對抗化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)的損傷作用［5－6］，其保護(hù)機(jī)制可能涉及多條信號通路。在多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，PI3K/Akt通路被證實(shí)是神經(jīng)保護(hù)的。例如，在鼠腦局灶性缺血/再灌注(I/R)損傷模型，PI3K/Akt通路的激活可以顯著減小腦損傷面積和神經(jīng)元的凋亡數(shù)目［9］。激活的 Akt還可保護(hù)鼠海馬神經(jīng)元［10－11］及皮層神經(jīng)元［4］對抗缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的凋亡。

為了探討PI3K/Akt通路是否參與H2S保護(hù)PC12細(xì)胞對抗化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)的損傷作用，本實(shí)驗(yàn)首先觀察H2S能否激活PI3K/Akt信號通路。研究結(jié)果表明，H2S供體NaHS呈濃度依賴性地引起PC12細(xì)胞Akt的活化。但是隨著NaHS濃度的增加，對p-Akt水平的促進(jìn)作用逐漸減弱，表明NaHS可以引起PC12細(xì)胞Akt的活化，但Akt的活化程度與其作用濃度有關(guān)。

為了證實(shí)Akt的活化是否由PI3K途徑介導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)在NaHS預(yù)處理前給予PI3K的抑制劑Ly294002。Ly294002是PI3K特異的拮抗劑，在許多研究中被用來抑制 PI3K的活性［12］。Akt位于PI3K的下游，PI3K可使Akt發(fā)生磷酸化具有活性，當(dāng)加入 PI3K抑制劑 Ly294002后，Ly294002裂解PI3K催化亞基 p110γ，并隨后抑制激活的 p-Akt。本研究發(fā)現(xiàn)，Ly294002能抑制NaHS預(yù)處理對Akt的活化。表明在PC12細(xì)胞中，NaHS是通過PI3K途徑引起Akt活化。新近研究結(jié)果也表明，NaHS可以促進(jìn)離體鼠心臟［13］及內(nèi)皮［14］等不同類型細(xì)胞PI3K途徑依賴的Akt活化，支持本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在上述研究基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步探討PI3K/Akt通路是否介導(dǎo)NaHS預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。為了闡明這一問題，在 NaHS預(yù)處理前給予PI3K抑制劑Ly294002，細(xì)胞損傷檢測結(jié)果表明，CoCl2明顯降低了細(xì)胞存活率，增加了細(xì)胞的凋亡;NaHS預(yù)處理使PC12細(xì)胞提高對CoCl2的抵抗能力，增加了細(xì)胞的存活率同時減少了凋亡。但是在NaHS預(yù)處理前使用Ly294002，則拮抗了NaHS預(yù)處理的細(xì)胞保護(hù)作用，使細(xì)胞的存活率下降及凋亡率增加。提示PI3K/Akt通路介導(dǎo)了NaHS預(yù)處理抗化學(xué)性缺氧的細(xì)胞保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)為深入闡明H2S的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制提供了新穎的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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