糖皮質(zhì)激素對哮喘大鼠肺組織IL-8表達(dá)的抑制作用

范曉云，汪 浩，徐 軻，唐 偉，陸兆雙

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸內(nèi)科，安徽合肥 230022;2.安徽醫(yī)科大學(xué)老年病研究所，安徽合肥 230022)

哮喘是一種由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病［1－3］。嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)是氣道慢性炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞，IL-8則是來源于多種細(xì)胞且對炎性細(xì)胞具有趨化作用的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、EOS遷徙和活化［4］，參與哮喘炎癥和變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。糖皮質(zhì)激素仍是目前治療哮喘最有效的藥物，可抑制趨化因子對中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的趨化作用和炎癥因子本身來減輕氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)。本研究通過建立哮喘大鼠動物模型，探討IL-8在哮喘炎癥中作用和抗炎藥物DXM對其影響，為將來把趨化因子作為設(shè)計哮喘藥物的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康♂SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑及試劑盒 卵白蛋白(OVA):Sigma公司;IL-8免疫組化試劑盒:美國ZYMED公司;Trizol試劑:美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒:日本Takara公司。DXM:山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 30只健康♂SD大鼠隨機(jī)分為正常組、哮喘組、DXM干預(yù)組。

1.2.2 哮喘大鼠模型建立(致敏和激發(fā)) 參照文獻(xiàn)復(fù)制哮喘大鼠模型［5］，哮喘組:d 1和d 8分別給予大鼠腹腔注射 OVA 1 mg和Al(OH)3100 mg無菌混懸液致敏。2周后將已致敏大鼠置于霧化箱中，用1%OVA霧化吸入激發(fā)，1次/天×30 min，連續(xù)7 d。哮喘大鼠表現(xiàn)為易激怒、呼吸急促、鼻翼煽動、進(jìn)食差、大小便失禁等癥狀。DXM干預(yù)組:致敏與激發(fā)同哮喘組，不同的是每日激發(fā)前半小時予DXM 1 mg·kg－1腹腔注射。正常組:致敏與激發(fā)階段OVA和DXM均用生理鹽水代替。

1.2.3 標(biāo)本采集和處理 各組大鼠均于末次激發(fā)24 h內(nèi)，以7%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，統(tǒng)一切取左肺肺組織10%甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋制作病理切片，肺組織病理切片染色證實有大量嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤等表示大鼠哮喘模型制備成功。檢測肺組織中IL-8蛋白表達(dá)。取右肺組織立即存放于 －80℃冰箱保存，供RTPCR使用。

1.2.4 肺組織病理觀察 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，行肺組織蘇木精－伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化。

1.2.5 大鼠肺組織IL-8蛋白表達(dá)檢測 SP法參照二抗試劑盒說明書進(jìn)行:切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)，IL-8一抗稀釋度為1∶350，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對照以PBS替代一抗。選擇切片中結(jié)構(gòu)較完整的支氣管，判斷標(biāo)準(zhǔn):陽性結(jié)果細(xì)胞質(zhì)著色呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選擇5個高倍鏡下支氣管切面(×400)，應(yīng)用捷達(dá)801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定陽性部位的平均光密度值(AOD)，代表陽性部位的蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 大鼠肺組織IL-8基因表達(dá)檢測 TRIzol提取總RNA并以260/280比值鑒定純度，一步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。根據(jù)GenBank查找IL-8核苷酸序列設(shè)計引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。IL-8:(323 bp)上游:5'TGG TCT CAG CCA CCC GC3'，下游:5'CCC TGT GGC TTG GCG G 3';β-actin:(191 bp)上游:5'AAC GAC CCC TTC ATT GAC 3'，下游:5'TCC ACG ACA TAC TCA GCA 3'。擴(kuò)增條件:94℃變性5 min，然后按以下條件進(jìn)行:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火40 s(IL-8)和55℃ 40s(β-actin)，72℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后于凝膠成像儀上拍照，圖像分析系統(tǒng)測定電泳條帶的以目的基因IL-8和內(nèi)參β－actin的積分光密度值(IOD)的比值表示目的基因的相對量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較，方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett's T3檢驗。

Fig 1 HE-stained lung tissue from rat of each group

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 正常對照組(Fig 1A)肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)有個別炎癥細(xì)胞滲出，支氣管壁及周圍可見極少量炎癥細(xì)胞。哮喘組(Fig 1B)肺組織結(jié)構(gòu)輕度破壞，支氣管上皮中度變性、壞死、脫落，支氣管壁明顯增厚，支氣管壁及周圍、血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有較多的炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚，組織黏膜充血水腫。地塞米松組(Fig C)肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔及支氣管周圍的炎癥改變較哮喘組明顯減輕。

Fig 2 RT-PCR electrophoretic analysis of IL-8 gene expression

2.2 糖皮質(zhì)激素對大鼠肺組織IL-8基因表達(dá)的影響 3組間肺組織IL-8 mRNA表達(dá)水平有明顯差異性(P＜0.01);正常組中大鼠肺組織IL-8 mRNA少量表達(dá)，在323 bp處可見陽性條帶，與設(shè)計片段大小符合(Fig 2)。與正常組相比，哮喘組大鼠肺組織IL-8 mRNA表達(dá)明顯增高，差異具有顯著性(P＜0.01)，與哮喘組比較，DXM治療后其表達(dá)均有所下降(P＜0.01)(Fig 3)。

Fig 3 Comparison of IL-8 mRNA(IOD)levels of lung tissue in three groups

2.3 糖皮質(zhì)激素對大鼠肺組織IL-8蛋白表達(dá)的影響 IL-8主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、支氣管周圍的淋巴濾泡炎性細(xì)胞及肺組織的單核巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中和肺泡間質(zhì)細(xì)胞中，呈棕黃色顆?；蚍伍g質(zhì)黃染，哮喘組表達(dá)最強(qiáng)，其次DXM組，正常組表達(dá)最弱(見Fig 4)。正常組的IL-8的表達(dá)與其他兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與哮喘組比較，DXM組的IL-8的表達(dá)減少，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

Fig 4 Expression of IL-8 in the lung section of rat of each group

3 討論

支氣管哮喘是當(dāng)今世界最常見的慢性疾病之一。特別是近20年來，哮喘的發(fā)病率增加，已將其列入二十一世紀(jì)急需防治的重大疾病之一。目前對哮喘的發(fā)生普遍認(rèn)為是氣道內(nèi)存在廣泛炎癥，主要包括氣道黏膜充血水腫明顯、氣道上皮損傷脫落、氣道內(nèi)黏液分泌增多及黏液栓的形成、上皮下可見嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞浸潤［6－7］。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。通過對氣道炎癥的研究，發(fā)現(xiàn)哮喘是一種主要由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和多種細(xì)胞因子共同參與的非特異性慢性氣道炎癥［8］。

其中，趨化因子引起中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞在氣道中的遷移和功能活化在哮喘的發(fā)生中具有極其重要的作用［9－10］。趨化因子的本質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)、功能相似，分子量在8～10 ku的小分子蛋白［11］。IL-8作為哮喘發(fā)病相關(guān)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要成員，是趨向性細(xì)胞因子超家族中的一員，具有趨化中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的作用，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞變形、激活，使其定向游走，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度一過性升高，誘導(dǎo)其脫顆粒、釋放蛋白水解酶和氧自由基、花生四烯酸等一系列炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)黏附分子的表達(dá)，引起呼吸爆發(fā)［12］，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)［13］。同時，IL-8趨化并激活嗜酸性粒細(xì)胞合成與釋放陽離子蛋白，并能引起氣道黏膜下微血管通透性增加、腺體分泌亢進(jìn)、平滑肌收縮及氣道上皮細(xì)胞脫落，參與哮喘急性發(fā)作期和非急性發(fā)作期的炎癥反應(yīng)，屬調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥的上調(diào)因子;我們前期利用陽離子蛋白類似物多聚左旋精氨酸作用于氣道上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清液中IL-8分泌增加［14］，說明IL-8和陽離子蛋白相互作用，進(jìn)一步加重氣道炎癥。IL-8可促使嗜堿性粒細(xì)胞趨化，并在IL－3存在情況下引起嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺及白三烯，介導(dǎo)不依賴于IgE的變態(tài)反應(yīng)，從而在遲發(fā)性哮喘中也起一定的作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)哮喘大鼠模型血清、肺泡灌洗液中IL-8水平明顯高于正常組［15］，我們通過RT-PCR和免疫組化半定量法對大鼠肺組織IL-8基因和蛋白進(jìn)行檢測，又發(fā)現(xiàn)哮喘組IL-8基因和蛋白表達(dá)顯著高于對照組，動物實驗進(jìn)一步證實IL-8參與了支氣管哮喘的發(fā)作，這一結(jié)果與有關(guān)哮喘患者的報道結(jié)果相符［13］，因此可以看出IL-8參與哮喘的炎癥過程，故IL-8水平的監(jiān)測可作為反映支氣管哮喘氣道炎癥和觀察病情變化的重要指標(biāo)。Xatzipsalti等［16］在哮喘患者支氣管上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)IL-8基因表達(dá)及其分泌的IL-8增加。IL-8可以通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞遷徙和活化，引起中性粒細(xì)胞向炎癥部位聚集而產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，同時，聚集至氣道的中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞又能分泌IL-8，形成循環(huán)通路，導(dǎo)致和加重哮喘的發(fā)作［17］，由此可見，IL-8在哮喘的發(fā)病過程中起著十分重要的作用。

目前，糖皮質(zhì)激素仍是指南推薦治療哮喘的首選藥物，實驗證實了經(jīng)DXM干預(yù)后肺組織中IL-8基因和蛋白表達(dá)水平明顯低于哮喘組，而高于正常組水平，與國內(nèi)外研究結(jié)果相符［18－20］。DXM 抑制IL-8介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，使嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞趨化、聚集過程受阻而起到很好的抗炎作用。由此可以推測糖皮質(zhì)激素DXM可能是通過下調(diào)趨化因子IL-8表達(dá)，從而減弱對嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的趨化、激活、聚集作用從而減輕氣道炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到治療哮喘的目的。

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