巴戟天低聚糖對Aβ25-35致擬癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響

陳地靈，張 鵬，林 勵(lì)，張鶴鳴，劉頌豪

巴戟天為茜草科植物巴戟天(Morinda Officinalis How.)的干燥肉質(zhì)根。味甘、辛，性微溫，有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效。主要分布在福建、廣東、廣西、海南等省的熱帶和亞熱帶地區(qū)，是我國著名的“四大南藥”之一。巴戟天中主要含有糖類、蒽醌、氨基酸、脂類、有機(jī)酸等化合物及無機(jī)元素［1］。其中，低聚糖類物質(zhì)含量高，成分復(fù)雜，藥理作用明顯［2－10］，近幾十年來隨著糖類生物學(xué)的飛速發(fā)展，糖類化合物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性被闡明，它們所擔(dān)負(fù)的眾多生物學(xué)功能被人們所認(rèn)識，在藥物化學(xué)領(lǐng)域，糖類藥物的研究也愈來愈受重視，被認(rèn)為是當(dāng)前藥物發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物的重要來源之一。中醫(yī)理論認(rèn)為:腎為先天之本，腎藏精，主骨生髓，上通于腦。人的視、聽、嗅、感覺及思維、記憶等皆出于腦。因此中醫(yī)有“從腎論治”的治則來治療癡呆病癥。為闡述補(bǔ)腎藥巴戟天的補(bǔ)腎益腦作用，初步探討巴戟天低聚糖補(bǔ)腎益腦藥效作用及機(jī)制，為巴戟天新藥研究與開發(fā)提供基礎(chǔ)，同時(shí)也為補(bǔ)腎中藥在神經(jīng)退行性疾病方面的研究提供參考，作者開展了本項(xiàng)研究。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 桌面型數(shù)字式雙臂大鼠腦立體定位儀(瑞沃德生命科技有限公司);JM12001型電子天平(d=0.1 g);BP211D電子天平(d=0.01 mg，Sartorioμs德國);HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋;Thermo D-37520型高速冷凍離心機(jī)(德國Heraeus公司);Phs-25型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);庫侖陣列電化學(xué)高效液相色譜儀(美國ESA公司:Model 5600A－16通道檢測器，Model 582 solvent Delivery System，Model 542自動(dòng)進(jìn)樣器，CoularrayWin工作站)，Dionex Tcc-100型柱溫箱(美國戴安公司);3K超濾管(PALL公司);佳美SK-1快速混勻器(江蘇金壇市佳美儀器廠)。

1.2 試藥 Aβ25-35(A4559-1 mg，Sigma公司)，聚集態(tài)的Aβ25-35形成:取Aβ25-35用無菌生理鹽水配制成2 g·L－1，在37℃保溫箱中放置7 d，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的Aβ25-35，－20℃保存?zhèn)溆?安理申片(中國衛(wèi)材藥業(yè));重酒石酸去甲腎上腺素(NE，批號100169-199402);鹽酸多巴胺(DA，批號100070-200405);5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA，批號140737-200501);5-羥色胺鹽酸鹽(5-HT，批號111656-200401);以上四種對照品均購自中國藥品生物制品檢定所(供含量測定用);乙腈(色譜純，默克公司，批號 1489730-925)，其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級，3月齡，84只，雄性，體質(zhì)量180 g～220 g，飼養(yǎng)環(huán)境SPF級，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號:SCXK(粵)2008-0020，動(dòng)物使用許可證號:SYXK(粵)2008-0085。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模、給藥方案參考文獻(xiàn)［11］，并根據(jù)實(shí)際情況做適當(dāng)修改，SD大鼠適用性飼養(yǎng)3 d后，用30 g·L－1的戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)麻醉后，頭頂部去毛，消毒皮膚并切開，在顱骨上用牙鉆對稱打兩個(gè)孔(AP-3.6 mm，ML±2.5 mm，DV3.0 mm)即為海馬區(qū)注射點(diǎn)。每側(cè)注射5 μl(10 μg)聚集態(tài)的Aβ25-35，在5 min內(nèi)注完，并留針5 min。用骨蠟填補(bǔ)針孔，縫合皮膚并肌肉注射青霉素。假手術(shù)組注射等量的生理鹽水，單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒。手術(shù)后d 15分組給藥。

巴戟天低聚糖(OMO，自制，經(jīng)鑒定其純度＞95%)加蒸餾水配成20 g·L－1，備用。陽性藥安理申(鹽酸多奈哌齊片)研碎用前蒸餾水配置成混懸液 0.125 g·L－1，備用。

Tab 1 The experimental classification and dosage of administration

2.2 行為學(xué)檢測 采用水迷宮實(shí)驗(yàn)判斷大鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力，實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［12］，并做適當(dāng)修改，以定位航行、空間探索為指標(biāo)，記錄大鼠在120 s內(nèi)尋找平臺(tái)潛伏期及路程，以及大鼠在120 s內(nèi)在原平臺(tái)象限內(nèi)停留的時(shí)間及路程。實(shí)驗(yàn)總共進(jìn)行5 d，前4 d定位航行實(shí)驗(yàn)，第5 d空間探索實(shí)驗(yàn)。

2.3 OMO對模型大鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響 測定方法按課題組前期建立方法［13］進(jìn)行測定。

2.4 OMO對模型大鼠腦組織病理特征的影響

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟切片，厚度為5 μm，進(jìn)行蘇木素－尹紅(HE)染色，在2×400高倍顯微鏡下，進(jìn)行海馬椎體細(xì)胞，海馬CA1區(qū)、大腦皮質(zhì)和前腦基底核神經(jīng)元計(jì)數(shù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)組間的比較，用Dunnett’s檢驗(yàn)進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 行為學(xué)檢測結(jié)果 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期結(jié)果顯示，見Tab 2。潛伏期，與空白組比較，模型組顯著延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明造模更具顯著性，手術(shù)本身不造成傷害。與模型組比較，給藥組潛伏期明顯縮短并趨于穩(wěn)定，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

Tab 2 Effect of OMO on escape latency ofAβ25－35-treated rats in MWM

水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)總路程結(jié)果顯示，見Tab 3。與空白組比較，模型組航行路程延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，給藥組航行總路程縮短，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第4 d，差異更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

Tab 3 Effect of OMO on escape latency ofAβ25－35-treated rats in MWM

空間探索實(shí)驗(yàn)，見Tab 4，各組總路程差異沒有顯著性(P＞0.05)，提示各組大鼠在120 s內(nèi)游泳距離沒有差異，說明實(shí)驗(yàn)對大鼠游泳速度沒有影響?？瞻捉M大鼠在第一象限(即平臺(tái)原所在區(qū)域)游泳時(shí)間(27.36±3.38 s)長于其他象限，且差異具有顯著性，說明大鼠已對平臺(tái)形成記憶。與空白組比較，模型組在第一象限游泳時(shí)間(20.77±5.63 s)明顯較短，說明 Aβ25－35具有損害大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，OMO高劑量組(31.93±3.39 s)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，提示 OMO 具有改善 Aβ25－35致大鼠記憶功能障礙作用，其余各組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組比較，各給藥組在第一象限游泳時(shí)間明顯延長，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3.2 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)測定結(jié)果 由Tab 5可知，與空白組比較，模型組中5-HIAA和5-HT含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示 Aβ25－35對大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有影響;假手術(shù)組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示手術(shù)本身對其無影響。與模型組比較，各給藥組 NE、DA(除安理申 DA含量)、5-HIAA和5-HT含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示OMO具有促進(jìn)Aβ25－35擬癡呆大鼠模型腦組織中NE、DA、5-HIAA和5-HT等水平升高的功能。

Tab 4 The results of spatial probe test on rats treated by Aβ25－35

Tab 5 The results of neurotransmitter in brain tissue of Aβ25－35-treated rats

3.3 椎體細(xì)胞和神經(jīng)元計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)果見Fig 1，與空白組比較(30±2)，模型組(15±3)5個(gè)視野的海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞總數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，高劑量組(44±4)總數(shù)比空白組明顯多(P＜0.01)，其余各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與模型組比較，各給藥組海馬椎體細(xì)胞總數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。同時(shí)與空白組(477±52)比較，模型組(378±60)5個(gè)視野的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元總數(shù)明顯少于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，各給藥組神經(jīng)元總數(shù)明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

Fig 1 The results of vertebral cells and neurons of hippocampus on Aβ25－35-treated SD rats

Fig 2 The results of vertebral cells and neurons of cerebral cortex and nucleus of Meynert on Aβ25－35-treated SD rats

大腦皮質(zhì)和前腦基底核神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，結(jié)果見Fig 2，與空白組比較，模型組神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，給藥組神經(jīng)元總數(shù)明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

4 討論

學(xué)習(xí)記憶既是認(rèn)知活動(dòng)中的重要方面，也是智力結(jié)構(gòu)中的重要要素。學(xué)習(xí)和認(rèn)知記憶功能體現(xiàn)了腦的高級整合功能，其功能的減退、甚至喪失是腦衰老的一個(gè)重要標(biāo)志。AD患者的臨床表現(xiàn)為智力減退、近期記憶缺失，以及相關(guān)行為能力障礙，所以在AD的診斷和療效評價(jià)指標(biāo)中，學(xué)習(xí)記憶水平是最重要的因素。Morris水迷宮于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)并應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究的，其優(yōu)點(diǎn)是能提供較多的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，系統(tǒng)全面地考察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間認(rèn)知加工的過程，客觀地反映其認(rèn)知水平;將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶障礙和感覺、運(yùn)動(dòng)缺陷等分離開來，減少它們對學(xué)習(xí)記憶過程檢測的干擾;操作簡便，數(shù)據(jù)誤差較小等。本實(shí)驗(yàn)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aβ25－35模型組定位航行潛伏期明顯長于空白組，定位航行總路程明顯高于空白組，提示 Aβ25－35具有神經(jīng)毒性，可模擬癡呆長時(shí)記憶障礙特征［14］，提示本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型造模成功。給予OMO治療后，與模型組比較，大鼠記憶明顯改善，說明OMO具有改善癡呆模型大鼠記憶障礙的作用。

現(xiàn)代研究表明，學(xué)習(xí)、記憶功能的完善與中樞神經(jīng)功能的健全密切相關(guān)，由于衰老，大腦皮層出現(xiàn)萎縮導(dǎo)致神經(jīng)興奮性下降、神經(jīng)遞質(zhì)合成減少甚至喪失。研究發(fā)現(xiàn)，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)對學(xué)習(xí)記憶功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。AD的神經(jīng)化學(xué)變化涉及腎上腺素能、多巴胺能、5-羥色胺能等多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)［15］，隨著機(jī)體的老化，會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力的下降，同時(shí)腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝亦發(fā)生紊亂，出現(xiàn)NE、DA、5-HT等含量的下降，提示衰老過程中腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡遭到破壞，并與一些老年性疾如老年癡呆及腦功能的減退有關(guān)［16，17］。本研究結(jié)果顯示，大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ25－35可致大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量降低，給予OMO處理后，其水平恢復(fù)到正常，提示OMO改善學(xué)習(xí)記憶障礙與提高大腦神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。

近年發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)退行性疾病患者的特定神經(jīng)組織具細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，提示細(xì)胞凋亡可能參與這些疾病的病變過程［18］。還有人發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)突變型APP的轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬及皮層中有細(xì)胞凋亡［19］。這些證據(jù)都提示細(xì)胞凋亡參與AD的病變過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OMO具有抑制大鼠腦組織中海馬CA1區(qū)、皮質(zhì)和前腦基底核神經(jīng)元細(xì)胞的減少，提示其機(jī)制可能是抑制神經(jīng)元凋亡，從而達(dá)到抑制腦衰的發(fā)展，但其具體生物機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究闡述。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上說明了補(bǔ)腎要藥巴戟天低聚糖成分具有一定的提高學(xué)習(xí)記憶能力，與中醫(yī)臟象理論“腎主骨，生髓，通腦”相通，提示巴戟天可應(yīng)于神經(jīng)退行性疾病的防治，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究闡明。

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