陳小宇,祝愛珍,劉成成,朱錦燦,劉革修
(暨南大學(xué)血液病研究所,廣東廣州 510632)
川續(xù)斷屬于川續(xù)斷科川續(xù)斷屬,是一種多年生草本植物,主要生長于潮濕的山地。續(xù)斷是川續(xù)斷的干燥根提取物,在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中有滋補(bǔ)、抗骨質(zhì)疏松、抗衰老等的功效,能夠治療腰背痛、外傷血腫、先兆流產(chǎn)和骨折等疾病[1]。Li等[2]研究表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠通過激活PI3K/Akt通路抑制缺氧條件下心肌細(xì)胞的凋亡,Niu等[3]也通過研究證實(shí)了川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠激活p38和ERK1/2活性促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化,并且川續(xù)斷皂苷Ⅵ具有促進(jìn)大鼠體外間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)向成骨細(xì)胞增殖和分化的作用[4]。成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞由MSCs分化而來,MSC在適宜條件下還可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。機(jī)體內(nèi)成脂分化和成骨分化是相互制約、相互平衡的過程,目前實(shí)驗(yàn)已證實(shí)多種促進(jìn)成骨的藥物同時(shí)具有抑制成脂的作用,如維生素D3
[5]、利賽膦酸[6]、姜黃素[7]等,本研究就川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化影響進(jìn)行探討。
1.1 主要試劑 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株由本研究所凍存,川續(xù)斷皂苷Ⅵ購于四川維克奇生物公司,DMEM高糖培養(yǎng)液、胰酶購自Hyclone公司,胎牛血清、地塞米松、IBMX、胰島素、油紅O染液購自GIBCO公司,噻唑藍(lán)購自科昊公司,葡萄糖及游離脂肪酸檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所,RNAiso Reagent、cDNA合成試劑盒、RT-PCR試劑盒購自TOYOBO。
1.2 主要方法
1.2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng),置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱,每隔2 d換液1次,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。
1.2.2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長至完全融合后2 d開始誘導(dǎo)分化。即將DMEM完全培養(yǎng)液棄掉,換上含5 mg·L-1胰島素、0.5 mmol·L-1IBMX、1 μmol·L-1地塞米松的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng),2 d后再換用含5 mg·L-1胰島素的 DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d。隨后用DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 d。
1.2.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以3×103/孔的密度接種于96孔板,培養(yǎng)24h后換以含不同濃度(0、0.1、1、10、50、100 μmol·L-1)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的培養(yǎng)液,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,分別在24、48和72 h檢測其增殖活性。加入20 μl 5 g·L-1MTT 工作液,置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育,4 h后吸凈孔中液體,每孔加150 μl二甲基亞砜,震蕩10 min后在酶標(biāo)儀上讀取490 nm處的吸光度值。
1.2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種至48孔板,待細(xì)胞完全融合2 d后開始誘導(dǎo),分化過程中加入不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ(0、10、25、50 μmol·L-1),觀察其對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化的影響。
1.2.5 油紅O染色 誘導(dǎo)分化6 d后細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min后,用平衡鹽溶液(PBS)洗滌3次,加入油紅O染液孵育60 min,吸棄液體用PBS漂洗3次,倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況并攝像。加入異丙醇(每孔200 μl),5 min后通過酶標(biāo)儀測量A520nm處的吸光度值。
1.2.6 葡萄糖及游離脂肪酸含量測定 收集各組誘導(dǎo)分化第6天培養(yǎng)液,參照試劑盒操作手冊(cè)說明,檢測各組葡萄糖及游離脂肪酸含量。
1.2.7 Q-PCR檢測成脂分化基因的表達(dá) 收集各組成脂誘導(dǎo)分化第6天細(xì)胞,用TRIzol試劑提取總RNA,分光光度計(jì)測定總 RNA濃度,A260/A280均在1.8~2.0之間。應(yīng)用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用SYBR PremixEx TaqTM Real-time PCR試劑盒配制20 μl PCR反應(yīng)體系,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測成脂相關(guān)基因mRNA表達(dá),熒光定量PCR引物見Tab 1。PCR擴(kuò)增條件為:93℃ 3 min,然后 93℃ 1 min,60℃ 1 min,72℃ 1 min,共45個(gè)循環(huán)。以目的基因擴(kuò)增量/內(nèi)參照(GAPDH)基因擴(kuò)增量表示所要檢測基因的表達(dá)量。重復(fù)檢測3次,每次做3個(gè)復(fù)孔,分別計(jì)算同一樣品3個(gè)復(fù)孔的Ct值,以同一樣品中GAPDH Ct作為內(nèi)參照,分別計(jì)算各組2-ΔΔCt,用以±s表示PPARγ和C/EBP α mRNA相對(duì)表達(dá)量。
Tab 1 Primer sequences of the detected genes in Q-PCR analysis
2.1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響 與空白組相比,川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞有促進(jìn)增殖效應(yīng)(P<0.05),結(jié)果如Tab 2。作用24 h后,從川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度為1 μmol·L-1開始,OD值隨藥物濃度增加而升高。隨著處理時(shí)間延長到72 h,只有100 μmol·L-1川續(xù)斷皂苷Ⅵ組OD值高于空白組,其余組促增殖效應(yīng)不明顯(P>0.05)。
Tab 2 Effects of asperosaponinⅥon the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte(±s,n=5)
Tab 2 Effects of asperosaponinⅥon the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte(±s,n=5)
*P<0.05 vs control
ASA/μmol·L -124 h 48 h 72 h 0 0.336 ±0.01 0.614 ±0.02 0.824 ±0.03 0.1 0.345 ±0.02 0.574 ±0.09 0.815 ±0.06 1 0.372 ±0.03* 0.634 ±0.06* 0.827 ±0.04 10 0.391 ±0.01* 0.665 ±0.03* 0.829 ±0.08 50 0.377 ±0.01* 0.665 ±0.05* 0.849 ±0.05 100 0.363 ±0.03* 0.601 ±0.04 0.896 ±0.04*
2.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響 于誘導(dǎo)分化過程中加入不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ(0、10、25、50 μmol·L-1)處理 6 d,采用油紅 O染色,顯微鏡下觀察并攝像,如Fig 1所示,川續(xù)斷皂苷Ⅵ抑制成脂,隨著藥物濃度增加3T3-L1細(xì)胞中被染色的脂滴含量明顯下降。用異丙醇萃取油紅O后,不同濃度組OD值與對(duì)照組比較均明顯下降(P<0.05),見 Fig 2。
Fig 1 Oil red O staining after adipogenic induction of differentiation for 6 days
Fig 2 Effects of asperosaponinⅥon lipid accumulation after adipogenic induction of differentiation for 6 days
2.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響 誘導(dǎo)分化后第6天每組上清液中的葡萄糖及游離脂肪酸的濃度,結(jié)果顯示加入25、50 μmol·L-1川續(xù)斷皂苷Ⅵ組培養(yǎng)上清中葡萄糖高于對(duì)照(P<0.05),10 μmol·L-1川續(xù)斷皂苷Ⅵ抑制葡萄糖效應(yīng)作用不明顯(P>0.05);而各組游離脂肪酸濃度則均低于對(duì)照組(P<0.05),且呈劑量依賴性,見Fig 3。
Fig 3 Effects of asperosaponinⅥon the concentration of glucose(up)and non-esterified fatty acid(down)in culture supernatant after adipogenic induction of differentiation for 6 days
2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化過程中,加入 10、25、50 μmol·L-1濃度組的川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理6 d后均能明顯抑制PPARγ和C/EBP α mRNA表達(dá)(P<0.05),如Fig 4。各組PPARγ mRNA抑制率分別為 68.8%、42.2%、34.7%;C/EBP α mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比亦下降,各組分別為80.0%、32.3%、6.3%。為了研究川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂作用的時(shí)間點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)在成脂的不同時(shí)間(d 0~6,d 1~2,d 3 ~4,d 5 ~6)加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ(50 μmol·L-1),發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷皂苷Ⅵ在成脂不同時(shí)間點(diǎn)加入均有抑制作用,成脂分化d 3-4加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ抑制效應(yīng)最明顯(PPARγ和C/EBP α mRNA抑制率分別為19.6%、26.4%,P<0.05),見 Fig 5。
Fig 4 Effects of asperosaponinⅥat different concentrations on the transcriptional level of PPAR γ and C/EBP α mRNA after adipogenic induction of differentiation for 6 days
Fig 5 Effects of ASA VI(50 μmol·L -1)at various intervals on the transcriptional level of PPAR γ and C/EBP α mRNA after adipogenic induction of differentiation for 6 days
機(jī)體脂肪細(xì)胞分化過程包括定向分化和終末分化兩個(gè)階段[8]。由MSC向前體脂肪細(xì)胞分化的過程屬于定向分化,終末分化則是指前脂肪細(xì)胞形成成熟脂肪細(xì)胞的過程。前體脂肪細(xì)胞雖然具有成脂分化能力,但如果沒有外源性的成脂刺激,不會(huì)自發(fā)的進(jìn)入終末分化階段。研究顯示多種轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期蛋白參與了調(diào)節(jié)成熟脂肪細(xì)胞形成[9],其中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer-binding proteins,C/EBPs)是終末分化過程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子[10]。PPARs是一類能被過氧化物酶體增殖物激活的核內(nèi)受體家族,包括 PPARα、PPARβ 和 PPARγ,其中 PPARγ 與脂肪細(xì)胞分化最為密切。PPARγ與配體結(jié)合后被激活,與視黃酸X受體形成PPARγ-RXR異二聚體,進(jìn)一步同反應(yīng)元件結(jié)合激活靶基因最終導(dǎo)致終末分化的脂肪細(xì)胞形成[11]。C/EBP家族與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的 3個(gè)成員為:C/EBPα、C/EBPβ和 C/EBPδ。細(xì)胞接受成脂刺激后 C/EBPβ和 C/EBPδ的表達(dá)增加,促進(jìn)成脂分化。在成脂分化后期C/EBPβ和C/EBPδ降低。C/EBPα可結(jié)合和激活特異性基因的啟動(dòng)子,促進(jìn)脂肪細(xì)胞進(jìn)入終末分化階段[12]。本研究探討了川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖、成熟分化的影響及其機(jī)制。結(jié)果不僅發(fā)現(xiàn),在處理 24 ~72 h 期間,1 ~100 μmol·L-1濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ均顯示有促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖作用,其中10 μmol·L-1濃度組作用24 h后細(xì)胞增殖最明顯,隨著川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度增加,促增殖效應(yīng)不明顯;在處理72 h時(shí),只有100 μmol·L-1川續(xù)斷皂苷Ⅵ組細(xì)胞增殖明顯高于空白組,其余組促增殖效應(yīng)不明顯。該結(jié)果說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞有一定的促其增殖作用。這也可能提示存在川續(xù)斷皂苷Ⅵ在培養(yǎng)基中不穩(wěn)定或者被細(xì)胞代謝等因素。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)更主要發(fā)現(xiàn)有,10、25、50 μmol·L-1濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ能劑量依賴性抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化,降低脂肪細(xì)胞中脂滴聚集,減少成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液中葡萄糖的吸收利用,并減少培養(yǎng)液中游離脂肪酸的形成。Q-PCR檢測結(jié)果則顯示川續(xù)斷皂苷Ⅵ能下調(diào)成脂過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα基因表達(dá),也呈劑量依賴性。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)在成脂分化的不同時(shí)間點(diǎn)加入50 μmol·L-1川續(xù)斷皂苷Ⅵ均能下調(diào) PPARγ 和 C/EBPαmRNA表達(dá),說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能作用成脂終末分化的整個(gè)環(huán)節(jié),抑制脂肪細(xì)胞形成。但川續(xù)斷皂苷Ⅵ是否也能抑制成脂定向分化以及怎樣調(diào)節(jié)PPARγ和C/EBPα表達(dá)的信號(hào)機(jī)制還有待研究。
機(jī)體MSC是成脂分化和成骨分化的共同前體細(xì)胞,具有雙向性,但是相互制約。骨髓中MSC是造血干細(xì)胞微環(huán)境重要組成部分,也具有成骨和成脂雙向分化特性,向成骨細(xì)胞分化則對(duì)造血具有促進(jìn)作用[13],而向脂肪細(xì)胞分化則對(duì)造血具有負(fù)性作用[14]。在傳統(tǒng)中醫(yī)中川續(xù)斷皂苷Ⅵ已經(jīng)顯示具有治療骨質(zhì)疏松的作用,即促進(jìn)成骨作用,但在抑制成脂分化方面的研究較少。本研究結(jié)果則不僅可進(jìn)一步了解其藥理作用,同時(shí)可為研究臨床上骨髓脂肪化提供新的思路。
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