人可溶性sTNFR1及胞膜外區(qū)Ig融合基因重組腺病毒的真核表達(dá)及功能活性鑒定

馬佳佳，Nick Lu，陳必良

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032;2.Department of Allergy-immunology，Northwestern University USA Chicago 60611)

妊娠期哮喘是圍生期常見(jiàn)合并癥，其病因及發(fā)病機(jī)制目前仍未闡明。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為妊娠期哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)與母體多項(xiàng)炎癥及免疫因子水平變化有關(guān)［1］。有資料證實(shí)［2］，人腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factoralpha，TNF-α)與各種原因?qū)е碌娜焉锷砗?或)病理現(xiàn)象如免疫性疾病、感染的炎癥過(guò)程等密切相關(guān)，其廣泛的生物學(xué)功能通過(guò)與細(xì)胞表面膜受體可溶性腫瘤壞死因子受體1(soluble tumor necrosis factor receptor 1，sTNFR1)的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。TNF-α在影響淋巴細(xì)胞活化的同時(shí)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)和損傷雙重作用決定哮喘的臨床表現(xiàn)［3］。細(xì)胞表面 IgGFcγ 受體(Fc gamma receptors，F(xiàn)cγRs)是維持機(jī)體外周免疫耐受平衡的關(guān)鍵受體［4］，通過(guò)依賴(lài)胞質(zhì)區(qū)免疫受體抑制基序信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的方式，參與多種免疫應(yīng)答的啟動(dòng)與調(diào)節(jié)，對(duì)免疫細(xì)胞激活和增殖所產(chǎn)生的抑制效應(yīng)，已在炎性疾病的控制上顯示出巨大的潛力和價(jià)值［5］。本研究擬以基因工程手段將sTNFR1與人免疫球蛋白IgG1 Fc片段偶聯(lián)，制備雙體性嵌合基因的重組腺病毒，以探討其功能和抑制細(xì)胞外周免疫耐受偏移、失衡及其中和阻斷TNF-α活性能力，為靶向干預(yù)治療妊娠哮喘疾病作用機(jī)制研究提供新的解釋和依據(jù)。

1 材料

1.1 標(biāo)本來(lái)源 妊娠期哮喘婦女清晨空腹外周血10 ml取自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科住院患者(知情同意，按中華醫(yī)學(xué)會(huì)《支氣管哮喘防治指南》確診)。

1.2 主要試劑 腺病毒載體AdEasyTM系統(tǒng)包括穿梭載體pAdTrack-CMV、骨架載體 p AdEasy-1，E.coli DH5α、BJ5183均由美國(guó)芝加哥西北大學(xué)過(guò)敏和免疫學(xué)系Nick Lu博士惠贈(zèng)。人胚腎AD293細(xì)胞為本室保存。限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶(美國(guó)New England Biolabs);TNF-α、兔抗人sTNFR1多克隆抗體(美國(guó) I nvitrogen);CD4-異硫氰基(FITC)、CD25-藻紅蛋白(PE)、Foxp3-別藻藍(lán)蛋白(APC)(美國(guó)Cell Signaling Technology);人 I L-12、IL-4 ELISA 試劑盒(美國(guó)Rapid Bio Lab);MTT(美國(guó)Sigma)。

1.3 引物序列 根據(jù)GenBank中報(bào)道的sTNFR1，IgGFc基因序列設(shè)計(jì)特異引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成及測(cè)序。sTNFR1-F:5'-GAGCGAATCCATGGATAGTGTGTGTCCCCTCCGCTT-3';sTNFR1-R:5'-GTCGGTCGACGGATCCTCAAATGATCAGGGGCAACG-3'(下劃線為Hind III和EcoRI酶切位點(diǎn))。IgGFc-F:5'-CGGTATGAATTCATGTGGCAGCTGCTGGTACCATC-3';IgGFc-R:5'-CCCTAACCTCGAGTTATCCTCCTTTGTCCTATCTG-3'(下劃線為Hind III和Kpn I酶切位點(diǎn))。

2 方法

2.1 細(xì)胞分離與誘導(dǎo)培養(yǎng) Ficoll法分離獲得妊娠期哮喘婦女外周血單個(gè)核細(xì)胞，PBS調(diào)懸浮細(xì)胞密度5×106·L－1接種 RPMI 1640培養(yǎng)基，加入5 mg·L－1PHA-P增殖培養(yǎng)48～72 h，離心培養(yǎng)液－80℃凍存。按免疫磁珠分選試劑說(shuō)明操作，經(jīng)FITC-CD45，PE-CD3表面標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定T細(xì)胞純度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 目的基因克隆及穿梭質(zhì)粒重組 提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肥大細(xì)胞(MC)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分別以sTNFR1-F/R、IgGFc-F/R為引物擴(kuò)增目的基因sTNFR1和 IgGFc。退火溫度58℃，共25個(gè)循環(huán)。凝膠電泳鑒定后以sTNFR1、IgGFc產(chǎn)物為模板，sTNFR1-F、IgGFc-R為引物進(jìn)行重疊PCR。退火溫度60℃，共25個(gè)循環(huán)。純化拼接片段通過(guò)HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切插入pAdTrack-CMV載體，經(jīng)T4連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，篩選的陽(yáng)性克隆HindⅢ、KpnⅠ雙酶切并行測(cè)序和Blast比對(duì)。

2.3 同源重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建 Pme I酶切pAdT-sTNFR1-Ig線性化片段轉(zhuǎn)入含pAdEasy-1的BJ5183中發(fā)生同源重組，卡那霉素LB平板37℃振搖過(guò)夜，抽提質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切鑒定，命名AdE-EGFP-sTNFR1-Ig，空腺病毒載體作為對(duì)照，命名AdE-EGFP。

2.4 腺病毒包裝、擴(kuò)增與鑒定 純化質(zhì)粒用LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)傳代、融合度達(dá)90%的AD293細(xì)胞，待細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)效應(yīng)廣泛形成后收集細(xì)胞，于37℃/－70℃間反復(fù)凍融4次，以1×105/孔接種96孔板，加入梯度稀釋(10－5～10－13)的病毒液 100 μl/孔，另設(shè)不含病毒對(duì)照。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)CPE形成并測(cè)定滴度。同時(shí)，以重組腺病毒及同法包裝的空載腺病毒感染細(xì)胞cDNA為模板，按前述條件及引物行PCR鑒定。

2.5 重組腺病毒感染效率測(cè)定 將MC接種于24孔板，加無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)24 h后，按預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選CPE所對(duì)應(yīng)病毒滴度的最佳結(jié)果，加入感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為50的病毒液，37℃、5%CO2孵育48 h，收獲細(xì)胞命名sTNFR1-Ig-MCs和 EGFP-MCs，分別于感染第 2、5、7 天熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)。

2.6 重組腺病毒在細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè) 提取感染細(xì)胞RNA，以cDNA產(chǎn)物為模板，按前述引物及條件RT-PCR鑒定sTNFR1-Ig基因mRNA表達(dá)，10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。同時(shí)取20 μg細(xì)胞總蛋白，以sTNFR1多克隆抗體(1∶500)為一抗、羊抗小鼠IgG-HRP(1∶2 000)為二抗，用Western blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 Foxp3表達(dá)百分率FCM檢測(cè) 將感染MC與培養(yǎng)純度達(dá)95%的T細(xì)胞按1∶5比例(MC細(xì)胞1×105/孔，T細(xì)胞5×105/孔)混合于96孔板中培養(yǎng)，另設(shè)單純T細(xì)胞對(duì)照孔。48 h后收獲細(xì)胞給予0.05 ng·L－1佛波酯、0.5 ng·L－1離子霉素和 2 μg·L－1莫能霉素共同刺激4 h，使用10 g·L－1皂苷破膜。按抗體說(shuō)明 EP管中先后加入 CD4-FITC，CD25-PE和Foxp3-APC，對(duì)照管中加入相應(yīng)同型對(duì)照，室溫避光反應(yīng)30 min。以PBS/多聚甲醛重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)，數(shù)據(jù)采用FlowJoV7.3軟件分析。

2.8 細(xì)胞因子水平ELISA檢測(cè) 收集的混合細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入不同細(xì)胞因子繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，并設(shè)立完全空白對(duì)照，72 h后收獲細(xì)胞。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行 IL-12和 IL-4檢測(cè)，結(jié)果以 ng·L－1表示。

2.9 細(xì)胞毒效應(yīng)MTT檢測(cè) 調(diào)轉(zhuǎn)染MC 5×104/孔接種96孔板，37℃孵育過(guò)夜，將倍比稀釋的細(xì)胞上清(10、20、40、60 和 80 mg·L－1)與 10 μg·L－1TNF-α和2 mg·L－1絲裂霉素C混均，培養(yǎng)24 h每孔加入 5 g·L－1MTT 20 μl繼續(xù)孵育4 h，DMSO150 μl水平震蕩裂解細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔并設(shè)空白對(duì)照孔。酶標(biāo)儀590 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，計(jì)算sTNFR1-Ig拮抗TNF-α對(duì)靶細(xì)胞毒效應(yīng)百分率/%=(實(shí)驗(yàn)組吸光度－對(duì)照組吸光度)×100%。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，細(xì)胞活性組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。

Fig 1 Cloning of target gen and construction of shuttle vector

3 結(jié)果

3.1 目的基因克隆及穿梭載體酶切鑒定 PCR擴(kuò)增的sTNFR1(558 bp)和IgGFc(232 bp)cDNA片段大小與預(yù)期一致，兩者嵌合后的產(chǎn)物片段長(zhǎng)約786 bp(Fig 1A)?？寺∪雙AdTrack-CMV后可見(jiàn)約786 bp的條帶(Fig 1B)，測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入的基因片段位置正確，表明重組穿梭載體含有的sTNFR1-IgGFc基因cDNA序列與設(shè)計(jì)相符。

3.2 同源重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 Pme I酶切線性化 pAdT-sTNFR1-Ig與 pAdEasy-1在BJ5183中完成同源重組，經(jīng)Pac I酶切后產(chǎn)生30 kb和4.5 kb特征性DNA條帶(Fig 2)，再次證實(shí)重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒同源重組成功。

3.3 重組腺病毒的生成及CPE效應(yīng) 線性化重組腺病毒包裝細(xì)胞48 h后熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光存在于細(xì)胞內(nèi)，且強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，表明細(xì)胞內(nèi)已有腺病毒復(fù)制。至5 d時(shí)細(xì)胞呈彗星狀;重復(fù)感染細(xì)胞至7 d時(shí)，細(xì)胞由貼壁狀態(tài)變圓懸浮甚至脫落，折光性增強(qiáng)并形成完全CPE效應(yīng)，滴度達(dá)3.7×1010～4.8×1010pfu/ml;而空腺病毒載體感染細(xì)胞僅有少量GFP且熒光強(qiáng)度較弱，未見(jiàn)明顯病毒增殖(Fig 3A)。瓊脂糖電泳顯示特異性預(yù)期大小786 bp目的片段(Fig 3B)，表明腺病毒包裝與擴(kuò)增成功。

Fig 2 Construction and verification of the recombinant adenovirus plasmid by agarose gel electrophoresis

3.4 重組腺病毒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá) 感染細(xì)胞48 h后熒光顯微鏡觀察約有90%以上的細(xì)胞表達(dá)GFP(Fig 4A，B);PCR擴(kuò)增獲得786 bp大小清晰條帶(Fig 4C);Western blot分析可見(jiàn)顯色后的蛋白樣品于95 ku處明顯上調(diào)(Fig 4D)，表明sTNFR1-Ig mRNA及蛋白能夠在感染MC中得到轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

3.5 重組腺病毒對(duì)T細(xì)胞表達(dá)Foxp3影響 細(xì)胞混合培養(yǎng)上清中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞水平明顯增高，IL-4水平降低(P＜0.05)，證實(shí)sTNFR1-Ig可促進(jìn)Foxp3+Treg的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致Th2/Treg所占CD4+T細(xì)胞比值下降(P＜0.05，F(xiàn)ig 5)。

Fig 3 Cytopathic effect of AD293 cells packed by recombinant adenovirus and PCR amplification

3.6 重組腺病毒對(duì)細(xì)胞因子免疫抑制 如Tab 1所示，與空白對(duì)照相比較，混合培養(yǎng)上清中sTNFR1-Ig-MCs組IL-12水平明顯增高，而IL-4維持在較低水平(P＜0.05)，EGFP-MCs組的各因子變化趨勢(shì)不明顯。

Fig 4 Verification of recombinant adenovirus infected MC cells

3.7 重組腺病毒拮抗TNF-α活性能力 不同濃度細(xì)胞培養(yǎng)上清均能中和TNF-α對(duì)靶細(xì)胞的免疫毒性，60 mg·L－1時(shí) sTNFR1-Ig仍可與 TNF-α 特異結(jié)合，完全抑制TNF-α的毒性效應(yīng)(P＜0.05);空腺病毒載體與空白對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)TNF-α毒性效應(yīng)的拮抗作用不足(Fig 6)。

Fig 5 Detection of Th2/Treg level in infected MC cells and T cells co-culture system by FCM

4 討論

大量的研究資料表明，TNF-α作為機(jī)體炎癥起始性、甚至損傷的重要介質(zhì)，通過(guò)受體作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)并促進(jìn)一系列與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子的黏附表達(dá)、肺部遷移和浸潤(rùn)［6］，增加對(duì)MC細(xì)胞的趨化作用，釋放的炎性介質(zhì)參與哮喘氣道炎癥的形成和疾病發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程，對(duì)維持氣道炎癥的持續(xù)存在起到了關(guān)鍵作用。然而，sTNFR競(jìng)爭(zhēng)性封閉TNF-α介導(dǎo)炎癥反應(yīng)作用受到更多重視［7］。

Tab 1 Comparison of cytokine levels in different cell groups(±s，ng·L －1)

Tab 1 Comparison of cytokine levels in different cell groups(±s，ng·L －1)

*P＜0.05 vs control group，EGFP-MCs group

Group IL-12 IL-4 Th1/Th2__Control 158.8 ±13.9 535.2 ±27.6 7.2 ±0.9 EGFP-MCs 166.5 ±11.1 497.5 ±24.1 9.3 ±1.2 sTNFR1-Ig-MCs 383.9 ±20.9*_236.6 ±17.4*__21.1 ±___3.7*__

Fig 6 Inhibition of TNF-α-dependent cytotoxicity by Ad-EGFP-TNFR1-Ig in vitro(±s)

AdEasyTM系統(tǒng)是將sTNFR1-Ig基因成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞的理想載體。目前，以此作為載體分析其對(duì)妊娠哮喘的免疫調(diào)節(jié)作用尚缺乏實(shí)驗(yàn)。本研究采用基因拼接方法獲得了全編碼嵌合基因，酶切鑒定和基因測(cè)序證實(shí)，其同源重組率與傳統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)重組法相比較更為有效，也使進(jìn)一步的病毒包裝以及感染效率檢測(cè)更為便捷［8］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)載體48 h后即可觀察到目的基因表達(dá);GFP陽(yáng)性細(xì)胞感染性病毒滴度的遞增，以及雜交出的條帶均說(shuō)明，裂解期sTNFR1-Ig基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到感染細(xì)胞以及靶細(xì)胞的基因組中。提示骨架質(zhì)粒與穿梭質(zhì)粒發(fā)生了有效同源重組，獲得病毒繁殖感染性滴度高效且穩(wěn)定，能夠滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

一直以來(lái)，Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答及Th1/Th2細(xì)胞失衡被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的核心環(huán)節(jié)［9］。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細(xì)胞的失衡只是哮喘發(fā)病的表面現(xiàn)象，而機(jī)體對(duì)外源變應(yīng)原的免疫耐受遭到破壞，Th2/Treg細(xì)胞失衡更代表了哮喘的免疫學(xué)發(fā)病基礎(chǔ)［10］。尤其是Treg表達(dá)調(diào)節(jié)T細(xì)胞特異性Foxp3細(xì)胞核內(nèi)蛋白，能直接拮抗Th2細(xì)胞相關(guān)因子產(chǎn)生和EOS在氣道內(nèi)的聚集以及MC的致炎作用，在維持機(jī)體免疫耐受抑制炎癥反應(yīng)性疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

在闡明Th2對(duì)Treg細(xì)胞免疫抑制抵抗在妊娠期哮喘的可能作用及相關(guān)機(jī)制方面，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)sTNFR1-Ig修飾的混合培養(yǎng)上清中IL-12呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，表明存在Treg及Th1細(xì)胞的功能障礙。筆者認(rèn)為，引發(fā)這種變化的原因是隨著病情發(fā)展，妊娠哮喘母體內(nèi)的sTNFR1水平已處于相對(duì)不足狀態(tài)，由于拮抗TNF-α細(xì)胞毒能力減低，無(wú)法有效抑制CD4+IL-4+Th2細(xì)胞活化閾值，以及改變炎癥激活細(xì)胞內(nèi)抑制信號(hào)引發(fā)的機(jī)體免疫調(diào)節(jié)失衡，從而導(dǎo)致Th0向Th1方向分化受阻，加劇了Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)狀態(tài)。Th2/Treg細(xì)胞間的平衡改變，免疫抑制抵抗力的減低，均促使妊娠母體對(duì)病毒的易感性增加。本結(jié)果與哮喘發(fā)生時(shí)Th2細(xì)胞關(guān)鍵效應(yīng)占主導(dǎo)地位狀態(tài)及病理過(guò)程相似，與文獻(xiàn)報(bào)道Treg細(xì)胞的低表達(dá)，可能是引發(fā)哮喘發(fā)病機(jī)制［11］的學(xué)說(shuō)觀點(diǎn)不謀而合。表明重組腺病毒感染所致體內(nèi)Treg水平恢復(fù)對(duì)Th2細(xì)胞裂解性周期復(fù)制形成抵抗，與疾病活動(dòng)期sTNFR1-Ig基因修飾后的MC對(duì)同種T細(xì)胞的刺激明顯下調(diào)有關(guān)。

筆者推測(cè)，sTNFR1-Ig對(duì)抑制妊娠期哮喘發(fā)作可能充當(dāng)了“推動(dòng)”和(或)“支持”性抗體作用，通過(guò)阻斷TNF-α與TNFR的有效結(jié)合，使TNF-α的異常分泌狀態(tài)隨病情緩解呈減弱趨勢(shì)，從而減輕患者肺部的病理?yè)p傷。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)sTNFR1-Ig參與的免疫調(diào)控與妊娠期哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，說(shuō)明sTNFR作為膜受體的清除形式使細(xì)胞對(duì)TNF系統(tǒng)的反應(yīng)性下降;Treg通過(guò)調(diào)控Th細(xì)胞，分泌TGF-β來(lái)發(fā)揮專(zhuān)職性抑制并消除Th2細(xì)胞對(duì)其的抵抗，進(jìn)而恢復(fù)Th1/Th2及Treg細(xì)胞平衡，這種雙向性變化在調(diào)節(jié)妊娠哮喘感染的免疫應(yīng)答發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

為評(píng)估sTNFR1-Ig的免疫活性，本研究采用MTT法對(duì)腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中殘存TNF-α細(xì)胞毒活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)，表達(dá)sTNFR1-Ig的上清可有效中和并減低TNF-α濃度。說(shuō)明含有Fc片段類(lèi)雙價(jià)抗體似的嵌合蛋白既可特異地與TNF-α結(jié)合，加速了體內(nèi)免疫復(fù)合物的清除。兩者的偶聯(lián)，通過(guò)抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，具有比sTNFR單體更強(qiáng)的免疫抑制能力，延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期，這不僅競(jìng)爭(zhēng)性地抑制TNF-α與膜受體的結(jié)合［12］，而且在轉(zhuǎn)錄水平還可拮抗TNF-α毒性作用的發(fā)揮并使其生成受到影響。此現(xiàn)象或許能夠解釋在妊娠期哮喘發(fā)病過(guò)程中，當(dāng)母體受到TNF-α病理?yè)p傷時(shí)，可通過(guò)sTNFR1-Ig啟動(dòng)體內(nèi)免疫保護(hù)機(jī)制，阻斷TNF-α的信號(hào)通路使病情得到緩解。本結(jié)果可以推斷，TNF-α不僅從多方面參與了妊娠期哮喘的免疫損傷，或者說(shuō)妊娠期哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在TNFR基因的水平變化，這些都為妊娠期哮喘機(jī)制研究及生物治療提供支持并帶來(lái)希望。

總之，探求sTNFR1-Ig在體內(nèi)參與妊娠期哮喘病理生理改變的途徑和作用仍需大量體內(nèi)、外及細(xì)胞學(xué)之間的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。本研究重組腺病毒載體的成功構(gòu)建，對(duì)闡明sTNFR1-Ig基因信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)節(jié)點(diǎn)，從蛋白和(或)基因水平找到探索妊娠期哮喘發(fā)病機(jī)制新線索，提供了很好的研究方向，為重新審視和制定妊娠期哮喘免疫靶向干預(yù)提供了新的思路和切入點(diǎn)。

［1］Lim R H，Kobzik L.Maternal transmission of asthma risk［J］.Am J Reprod Immunol，2009，61(1):1－10.

［2］Bogas M，Leandro M J.Biologic therapy and pregnancy.A systematic literature review［J］.Acta Reumatol Port，2011，36(3):219－32.

［3］Desai D，Brightling C.Cytokines and cytokine-specific therapy in asthma［J］.Adv Clin Chem，2012，57:57－97.

［4］Nimmerjahn F，Ravetch J V.FcγRs in health and disease［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2011，350:105－25.

［5］Bruhns P.Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models［J］.Blood，2012，119(24):5640 －9.

［6］Choi J P，Kim Y S，Kim O Y，et al.TNF-alpha is a key mediator in the development of Th2 cell response to inhaledallergens induced by a viral PAMP double-stranded RNA ［J］.Allergy，2012，67(9):1138－48.

［7］Wallis R S.Biologics and infections:lessons from tumor necrosis factorblocking agents［J］.Infect Dis Clin North Am，2011，25(4):895－910.

［8］Huang P I，Lo W L，Cherng J Y，et al.Non-viral delivery of RNA interference targeting cancer cells in cancer gene therapy［J］.Curr Gene Ther，2012，12(4):275－84.

［9］Wegmann M.Th2 cells as targets for therapeutic intervention in allergicbronchial asthma［J］.Expert Rev Mol Diagn，2009，9(1):85－100.

［10］Palomares O，Yaman G，Azkur A K，et al.Role of Treg in immune regulation of allergic diseases［J］.Eur J Immunol，2010，40(5):1232－40.

［11］KazaniS，Israel E.Update in asthma 2011［J］.Am J Respir Crit Care Med，2012，186(1):35－40.

［12］Gómez M I，O'Seaghdha M，Magargee M，et al.Staphylococcus aureus protein A activates TNFR1 signaling through conserved IgG binding domains［J］.J Biol Chem，2006，281(29):20190－6.