酸敏感離子通道1a在酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的作用及其機(jī)制研究

張晨晨，唐 杰，胡 偉，葛金芳，林梅英，陳飛虎

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽合肥 230601)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，慢性多關(guān)節(jié)炎癥為其主要臨床表現(xiàn)。研究表明RA關(guān)節(jié)局部組織酸化導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞是RA致殘的主要原因［1－2］，積極尋找導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞及骨組織病理生理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)并以此為靶點(diǎn)開發(fā)新型治療藥物成為該病的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是一類由細(xì)胞外H+直接激活的陽(yáng)離子通道，屬于 ENaC(epithelial Na+channel)/DEG(degenerin)超家族。當(dāng)胞外pH降低時(shí)，開放的通道對(duì)Na+、Ca2+具有通透性，進(jìn)而引起細(xì)胞一系列生理病理變化［3］。本課題組前期研究證實(shí)ASIC1a在模擬RA發(fā)病歷程的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)關(guān)節(jié)軟骨上有較強(qiáng)表達(dá)，抑制ASICs，尤其是ASIC1a的表達(dá)可抑制胞外酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用［4－5］。提示 ASIC1a在組織酸化導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用，但具體機(jī)制不清。

自噬和凋亡是細(xì)胞在炎癥等不良刺激下的主要應(yīng)激反應(yīng)形式。文獻(xiàn)報(bào)道［6］，RA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的自噬過度激活在關(guān)節(jié)破壞中發(fā)揮重要作用。本研究以大鼠原代軟骨細(xì)胞為研究對(duì)象，采用胞外酸化模擬AA大鼠關(guān)節(jié)滑液環(huán)境，研究ASIC1a是否在酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬中發(fā)揮作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠25只，♂，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):皖動(dòng)準(zhǔn)字01號(hào)。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20℃ ～25℃，濕度在50% ～60%，自由飲水。

1.2 藥物和試劑 Amiloride，Sigma公司產(chǎn)品;PcTX1，Alomone公司產(chǎn)品;PD98059和 SB203580，Tocris Bioscience公司產(chǎn)品;抗LC3抗體購(gòu)自Sigma公司;抗ERK1/2抗體、抗p38MAPK抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;抗 pERK1/2抗體、抗 pp38MAPK抗體購(gòu)自CST公司;Ⅱ型膠原酶，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，臨用時(shí)現(xiàn)配;胰蛋白酶，高糖DMEM液體培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品;胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品;D-Hanks溶液，碧云天公司產(chǎn)品;Alcian染液試劑盒，瑞士Fluka公司產(chǎn)品;TRIzol試劑，美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒，立陶宛Fermentas公司產(chǎn)品;ECL顯色試劑盒，Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.3 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定 按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)［5］，采用 Alcian染色法進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的鑒定，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4 軟骨細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)及藥物處理

1.4.1 將軟骨細(xì)胞分別在 pH 為 7.4、7.0、6.5、6.0、5.5不同的胞外環(huán)境下培養(yǎng)3 h，觀察細(xì)胞自噬情況，建立關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬體外模型。

1.4.2 將軟骨細(xì)胞分組如下:pH 7.4正常組、pH 6.0 組、pH 6.0+Amiloride 組(100 μmol·L－1)、pH 6.0+PcTX1 組(100 μg·L－1)。各組于給藥30 min后，加入pH 6.0的培養(yǎng)基共培養(yǎng)3 h，收集細(xì)胞檢測(cè)ASIC1a活化后，酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬及ERK1/2、p38MAPK蛋白磷酸化水平的變化及抑制ASIC1a的表達(dá)對(duì)上述指標(biāo)的影響。

1.4.3 將軟骨細(xì)胞分為pH 7.4正常組，pH 6.0酸化組，pH 6.0+PcTX1組，以及經(jīng) ERK1/2、p38MAPK磷酸化抑制劑(PD98059、SB203580)處理的酸化組。各組于給藥30 min后，加入pH 6.0的培養(yǎng)基共培養(yǎng)3 h，收集細(xì)胞檢測(cè) ERK1/2及 p38MAPK在ASIC1a調(diào)控大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬中的作用。

1.5 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)軟骨細(xì)胞自噬基因Beclin-1 mRNA表達(dá) 將1×106個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)分組同1.4.2、1.4.3。按 TRIzol一步法提取細(xì)胞總 RNA，以紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA含量和純度(RNA在260 nm和280 nm的光密度比值為1.8～2.0之間)，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28S和18S RNA條帶比值I＞2.0)。用5 μg總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，用β-actin為內(nèi)標(biāo)。根據(jù)基因Gene bank提供的Beclin-1和β-actin序列，由上海生工生物有限公司合成引物，Beclin-1的序列為:Forward primer:5'-GGAGATGTTGGAGCAAATGAA-3'，Reverse primer:5'-GTCGCATTGAAGACATTGGTT-3'，PCR反應(yīng)產(chǎn)物長(zhǎng)度為321bp。β-actin的序列為:Forward primer:5'-ACCACAGCTGAGGGAAATCG-3'，Reverse primer:5'-AGA GGTCTTTACGGATGTCAACG-3'，PCR反應(yīng)產(chǎn)物長(zhǎng)度為345 bp。Beclin-1、β-actin反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃5 min;變性 94℃ 40 s;退火 51℃ 40 s;延伸 72℃1 min;35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用凝膠自動(dòng)成像2 000系統(tǒng)掃描，取其分值作為量化指標(biāo)，以特異性基因條帶與β-actin基因條帶的密度比值表示不同樣本間的相對(duì)量。以3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 Weston blot檢測(cè)自噬蛋白LC3的表達(dá) 將軟骨細(xì)胞消化，以1×106個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)分組同“1.4”。加入pH 6.0的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗滌3遍，每瓶加入400 μl RIPA裂解液(含10%PMSF)裂解30 min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，離心取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將上清與上樣緩沖液按4∶1的比例進(jìn)行分裝，100℃煮10 min變性，－80℃保存待用。等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST洗膜10 min。室溫下用含5%脫脂奶粉(TBST溶解)封閉3 h。隨后加入一抗(1∶500)4℃孵育過夜。TBST洗脫4次，加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h，漂洗4次。將PVDF膜用化學(xué)發(fā)光劑ECL染1 min，暗室中曝光到X線片上。結(jié)果采用Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)分析。

1.7 透射電子顯微鏡法觀察自噬小體數(shù)量的變化將軟骨細(xì)胞以1×106個(gè)接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)分組同“1.4.2”。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行收集，4℃，1 200 r·min－1離心5 min成肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)塊，棄去上清液，加入 PBS洗1次后進(jìn)行離心4℃，1 200 r·min－15 min。先用預(yù)冷的2.5%戊二醛4℃固定2 h，在經(jīng)緩沖液多次清洗后，用1%的鋨酸在4℃下后固定1.5 h。經(jīng)梯度丙酮脫水(先90%丙酮一次15 min，后100%丙酮3次每次10 min)，采用環(huán)氧樹脂618 60%浸透包埋，樣品包埋后進(jìn)入烤箱進(jìn)行聚合，經(jīng)過 37℃(16 h)、45℃(12 h)、60℃(14 h)聚合變硬后，用溫水將膠囊殼去除，擦凈包埋塊，備切片使用。超薄切片機(jī)切片，染色后電子透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定 剛分離的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞呈圓球形，懸浮狀態(tài)(Fig 1a)，培養(yǎng)24 h后，一些細(xì)胞開始貼壁，伸展形成突起(Fig 1b)，培養(yǎng)72 h后細(xì)胞貼壁較多，成簇生長(zhǎng)，逐漸伸展為多角形并連接成片(Fig 1c)，軟骨細(xì)胞經(jīng)愛先藍(lán)染液鑒定顯示細(xì)胞分泌蛋白多糖呈藍(lán)色，胞核部分呈清晰的紅色，細(xì)胞呈梭形鋪路石狀排列(Fig 1d)。

Fig 1 Morphological observation of the articular chondrocytes(×200)

2.2 胞外酸化對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞自噬的活化作用 不同pH的胞外環(huán)境對(duì)軟骨細(xì)胞自噬的影響與酸性程度成正相關(guān)，如圖所示，與pH 7.4正常組相比，軟骨細(xì)胞自噬蛋白LC3表達(dá)量隨胞外酸化程度的增加而升高。其中 pH 6.0、pH 5.5組與pH 7.4組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 2)，且這兩組之間LC3表達(dá)量基本一致，本實(shí)驗(yàn)中選取pH 6.0為胞外酸化條件。

2.3 ASIC1a對(duì)酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的影響

2.3.1 ASIC1a對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Beclin-1 mRNA表達(dá)的影響 結(jié)果如圖所示，與正常組相比，酸化刺激組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Beclin-1 mRNA表達(dá)明顯增加，且差異具有顯著性(P＜0.01)。與酸化組比較，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1組可抑制大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Beclin-1 mRNA表達(dá)(Fig 3)。

2.3.2 ASIC1a對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與pH 7.4組相比，酸化組大鼠軟骨細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)明顯增加，且差異具有顯著性(P＜0.01)。與酸化組比較，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1組可抑制大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)(Fig 4)。

M:DNA marker;1:Control;2:pH 6.0 group;3:pH 6.0+Amiloride group;4:pH 6.0+PcTX1 group.＊＊ P＜ 0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs pH 6.0 group

2.3.3 ASIC1a對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬小體數(shù)量的影響 采用透射電子顯微鏡法觀察各組細(xì)胞自噬小體數(shù)量的變化。如圖所示，正常組軟骨細(xì)胞胞質(zhì)中可見較完整的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，且形態(tài)規(guī)則(Fig 5a)，與pH 7.4組相比，酸化組軟骨細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)較多的由雙層膜包裹的細(xì)胞自噬小體(Fig 5b)，與酸化刺激組比較，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1組胞質(zhì)中自噬小體的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞器形態(tài)趨于正常(Fig 5d)。

Fig 4 Effect of ASIC1a on protein expression of LC3 in acid-induced chondrocytes(±s，n=3)

Fig 5 Representative ultrastructural morphology of autophagy(×20 000)

2.4 ASIC1a對(duì)酸化的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ERK1/2和p38MAPK蛋白磷酸化的影響 Western blot結(jié)果如圖所示，與pH 7.4組比較，酸化刺激組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ERK1/2、p38MAPK磷酸化蛋白表達(dá)均明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與酸化組相比，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1組可抑制ERK1/2及p38MAPK磷酸化蛋白表達(dá)(Fig 6)。

Fig 6 Effects of acid-sensing ion channel 1a on phosphorylation of ERK1/2 and p38 in acid-induced articular chondrocytes( ± s，n=3)

2.5 ERK1/2、p38MAPK 在 ASIC1a調(diào)控大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬中的作用

2.5.1 ERK1/2、p38MAPK 對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Beclin-1 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果如圖所示，與pH 7.4正常組比較，酸化組Beclin-1 mRNA表達(dá)量升高，且差異具有顯著性(P＜0.01)。與酸化組比較，ASIC1a特異性阻滯劑 PcTX1、ERK1/2磷酸化抑制劑PD98059預(yù)處理組抑制Beclin-1 mRNA表達(dá)。而與酸化組比較，p38MAPK抑制劑SB203580未明顯改變大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Beclin-1 mRNA表達(dá)(Fig 7)。

2.5.2 ERK1/2、p38MAPK 對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響 Westernblot結(jié)果顯示，與pH 7.4正常組比較，酸化組LC3蛋白表達(dá)量升高。ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1、ERK1/2磷酸化抑制劑PD98059預(yù)處理組與酸化組相比LC3蛋白表達(dá)量降低，而p38MAPK抑制劑SB203580組LC3蛋白表達(dá)量沒有明顯改變(Fig 8)。

Fig 7 Effect of inhibitor of phosphorylated ERK1/2 and p38MAPK on mRNA expression of Beclin-1(±s，n=3)

3 討論

細(xì)胞自噬(autophagy)是一種溶酶體依賴性的細(xì)胞內(nèi)多余大分子物質(zhì)和受損細(xì)胞器降解的過程，生命體借此維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定。過度的自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡，稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡［7］。研究表明［8－9］，自噬水平的異常與神經(jīng)退行性疾病、腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)展有關(guān)。饑餓、缺氧和胞外酸化是誘發(fā)自噬活化的主要原因。組織酸化性疾病RA患者關(guān)節(jié)軟骨上也存在有自噬的激活并在關(guān)節(jié)破壞中發(fā)揮重要作用［6］，但具體機(jī)制尚不清楚。

軟骨細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的失衡是參與關(guān)節(jié)軟骨損傷的主要形式［10］。本課題組前期研究已證實(shí)，AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的酸化刺激可誘導(dǎo)ASIC1a激活繼而誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨損傷，抑制ASIC1a的表達(dá)能保護(hù)因酸化導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞損傷。但對(duì)于ASIC1a在自噬中的作用尚不清楚。本研究首先采用胞外不同pH刺激，觀察大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的自噬情況。結(jié)果表明，pH6.0和pH5.5均能明顯激活軟骨細(xì)胞自噬，表現(xiàn)為自噬標(biāo)志性蛋白LC3的表達(dá)升高，但pH 6.0和pH 5.5條件下差異無顯著性。在此基礎(chǔ)上，本研究選擇pH 6.0為胞外酸化條件，使用 ASIC1a非特異性和特異性阻滯劑，觀察了ASIC1a在酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬中的作用。結(jié)果表明，抑制ASIC1a的表達(dá)后自噬基因Beclin-1和自噬蛋白LC3表達(dá)均明顯降低。透射電鏡結(jié)果證實(shí)細(xì)胞自噬小體數(shù)量的變化與上述結(jié)果一致。提示抑制ASIC1a的激活參與酸化誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬。

Fig 8 Effect of inhibitor of phosphorylated ERK1/2 andp38MAPK on protein expression of LC3(±s，n=3)

MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞功能性調(diào)控上起重要作用，眾多研究表明，它參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和自噬［11］。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有極其重要的作用，幾乎參與了人體生命的所有活動(dòng)功能。持續(xù)升高的胞質(zhì)內(nèi)Ca2+可以激活ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路。ASIC1a屬于鈣滲透性酸敏感離子通道，胞外酸化激活可介導(dǎo)ASIC1a通道開放、胞外Ca2內(nèi)流引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)［12－13］。本研究結(jié)果表明，酸化刺激后大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞磷酸化狀態(tài)的ERK1/2和p38MAPK表達(dá)明顯增強(qiáng)，阻斷ASIC1a可抑制酸化刺激導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平升高，提示 ERK1/2和p38MAPK蛋白參與了ASIC1a介導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。進(jìn)一步采用ERK1/2、p38MAPK磷酸化抑制劑，觀察它們?cè)谒峄碳ふT導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬中的作用。結(jié)果表明，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1、ERK1/2磷酸化抑制劑PD98059均可明顯降低細(xì)胞 Beclin-1 mRNA和LC3蛋白表達(dá)。然而，p38MAPK磷酸化抑制劑SB203580組軟骨細(xì)胞的自噬水平則無明顯改變，提示ERK1/2參與了酸化刺激誘導(dǎo)ASIC1a激活繼而引發(fā)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的自噬過程，這與文獻(xiàn)報(bào)道的ERK1/2參與自噬過程的信號(hào)調(diào)控［14］的結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究證實(shí)胞外酸化刺激可激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬，阻斷大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ASIC1a的表達(dá)可有效減輕酸化刺激誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬，其機(jī)制可能與阻斷ASIC1a抑制ERK1/2磷酸化有關(guān)，這將為研究與酸化相關(guān)的關(guān)節(jié)疾病中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。然而，本研究?jī)H僅觀察了體外酸化環(huán)境下ASIC1a在軟骨細(xì)胞自噬激活與軟骨破壞中的作用，對(duì)于其在RA病程中各個(gè)時(shí)期的具體作用尚不清楚，有待于我們?cè)谝院蟮难芯恐胁扇≌w實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探索。

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