Jasplakinolide通過穩(wěn)定細胞骨架調控內皮細胞功能

靖 旭，孫金隆，張曉蕓，唐可欣，尹青令，吳海燕，王金紅，王濟濰，成 敏

(濰坊醫(yī)學院1.麻醉學系、2.醫(yī)學研究實驗中心，山東，濰坊 261053;3.山東大學醫(yī)學院，山東 濟南 250012)

隨著對血管內皮生物學功能研究的不斷深入，人們已經認識到內皮不僅是血管壁的襯里，而且具有復雜的表面結構和眾多的生理功能［1］，并在心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)調節(jié)中起著重要作用。因此，內皮損傷是導致心血管疾病如動脈粥樣硬化等發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［2－3］。內皮損傷表現(xiàn)為內皮細胞遷移、肥大、增殖和凋亡等，其細胞表型、形態(tài)結構與功能均發(fā)生改變。

細胞骨架是位于細胞核和細胞膜內側面的一種纖維狀蛋白基質，這些纖維狀結構在細胞內具有網狀、束狀或帶狀等不同形態(tài)，包括微絲、微管和中間纖維3種組成成分。其中微絲由單體狀態(tài)(G-actin)與聚合狀態(tài)(F-actin)兩種形式的肌動蛋白組成，調控細胞諸多生理活動，例如應力纖維的形成、細胞附著、遷移、凋亡、物質運輸、跨膜信息傳遞以及受體的聚集［4－6］。有研究提示內皮細胞結構和功能的完整性與肌動蛋白細胞骨架息息相關，而細胞骨架的損害往往先于內皮細胞形態(tài)結構的損傷［7］。故明晰肌動蛋白細胞骨架對內皮細胞功能的調控可進一步闡明動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病機制，為其防治提供理論及實驗依據(jù)。本研究利用細胞骨架聚合劑(Jasplakinolide，JAS)促進微絲的聚合，改變肌動蛋白細胞骨架，探討JAS對培養(yǎng)的HUVECs細胞生物特性的影響，以進一步闡明細胞骨架在內皮細胞功能調控中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs細胞株購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞庫。M199培養(yǎng)基(Gibco，美國);胎牛血清(Hyclone，美國);生長因子 VEGF、bFGF(invitrogen，美國);Matrigel(BD，美國);CCK8(DOJINDO，日本)，Phalloidin-FITC(ENZO，美國)，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(ROCHE，德國)，纖維粘連蛋白(Roche，德國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HUVECs于 37℃ 恒溫、含 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)液為全M199培養(yǎng)液(含 15%FBS、VEGF 10 μg·L－1及 bFGF 5 μg·L－1)。細胞用0.25%胰酶－0.02%EDTA消化傳代。

1.2.2 免疫熒光檢測細胞骨架 HUVECs胰酶消化后，接種于載玻片上。用含JAS(100 nmol·L－1)或DMSO的培養(yǎng)基分別孵育15 min、30 min、1 h及24 h后。取出載玻片，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10 min。用DAKO免疫組化筆畫標出染色區(qū)，加入F-actin免疫熒光染料Phalloidin-FITC，DNA免疫熒光染料DAPI，37℃孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察，每張載玻片取4個視野，觀察細胞骨架的改變。

1.2.3 細胞增殖能力測定 將經JAS或DMSO作用的HUVECs消化成單細胞懸液后接種于96孔板(4 000個細胞/孔)，待細胞融合80%左右，棄去各孔培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑和培養(yǎng)基的混合液(按1∶10比例)，在培養(yǎng)箱內孵育60 min，利用酶標儀測定各孔在450 nm波長的吸光度。

1.2.4 細胞粘附能力測定 用10 mg·L－1的纖維粘連蛋白預包被6孔板2 h，PBS洗3遍。HUVECs分別用JAS(100 nmol·L－1)和DMSO處理1 h后消化成單細胞懸液，分別接種于包被有纖維粘連蛋白的6孔板中。37℃，5%CO2孵育1 h后，PBS沖洗3次，每孔隨機取5個高倍鏡 (×100)視野計數(shù)貼壁細胞。

1.2.5 細胞遷移能力測定 采用改良的Boyden小室法觀察細胞遷移情況，胰酶消化經JAS和DMSO處理的HUVECs，用含10%血清的培養(yǎng)基制成懸液計數(shù)，50 μl細胞(2×104)懸浮液注入上室，用培養(yǎng)基加滿下室。置于37℃、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內。8 h后，刮去濾膜上面的未移動細胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，顯微鏡下隨機選取5個視野(×100)，計數(shù)遷移細胞，取其平均數(shù)。

1.2.6 細胞體外成血管能力測定 在預冷的96孔板中用Matrigel包被(冰上操作)，在細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。將HUVECs(2×107L－1)接種于包被有Matrigel的96孔板中，用DMSO、JAS干預1 h，換全M199繼續(xù)孵育6 h后倒置相差顯微鏡觀察，計數(shù)成血管數(shù)目，測量微血管長度及面積。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 所有實驗均重復3～4次。采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 JAS對 H UVECs細胞骨架的影響 JAS對HUVECs細胞骨架的作用具有時間依賴性:100 nmol·L－1JAS處理15 min后較 D MSO對照組，細胞微絲結構增多;JAS處理1 h后細胞骨架明顯變粗，熒光強度增加，而作用24 h后，細胞皺縮，細胞骨架聚集為團塊狀(Fig 1)。

2.2 JAS對HUVECs增殖能力的影響 以CCK-8法測定細胞的增殖能力，與DMSO處理的對照組比較，JAS對HUVECs的增殖無明顯影響(Fig 2)。

2.3 JAS對HUVECs黏附能力的影響 在黏附實驗中，將HUVECs與纖維黏連蛋白黏附1 h后，洗去未黏附的細胞，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，相同視野范圍內JAS處理組的HUVECs黏附細胞數(shù)(41.43±1.631)明顯多于DMSO對照組(32.86±2.098)，即JAS增加HUVECs與細胞外基質——纖維黏連蛋白的黏附 (P＜0.05)(Fig 3)。

Fig 1 Time-dependent effects of JAS on actin distribution of HUVECs(×200)

Fig 2 Effect of JAS on cell proliferation of HUVECs

Fig 3 JAS enhances the adhesion of HUVECs

2.4 JAS對 HUVECs遷移能力的影響 Boyden小室細胞遷移實驗證實JAS增強HUVECs的遷移，其遷移細胞數(shù)分別為 21.09±1.648(JAS組)，16.09±1.826(DMSO組)(Fig 4)。

2.5 JAS對HUVECs體外成血管能力的影響 體外成血管實驗顯示，HUVECs具有體外成血管能力，種植于Matrigel上的細胞首尾相連成條索狀，形成血管網樣結構。JAS可明顯促進HUVECs體外管樣結構的形成(Fig 5A)，圖像分析及統(tǒng)計學結果顯示，JAS處理組HUVECs形成的血管樣結構其管腔長度及面積均高于 DMSO處理組(Fig 5B，C)(P＜0.05)。

Fig 4 Modified Boyden chamber analyse the effect of JAS on the migration of HUVECs

3 討論

肌動蛋白細胞骨架可以通過控制自身的聚合和解聚導致細胞骨架發(fā)生重排，而細胞骨架的重組和分布的改變，將直接影響細胞內信號的整合和轉導、細胞周期的改變和基因表達，進而影響細胞增殖、分化、遷移、分裂和黏附能力［8］。為了研究細胞骨架在內皮細胞生理功能中的作用，本研究利用細胞骨架聚合劑JAS促進微絲的聚合，改變肌動蛋白細胞骨架。結果顯示:JAS對HUVECs細胞骨架的作用具有時間依賴性，JAS短時間(譬如15 min或1 h)作用于HUVECs，細胞內微絲結構明顯增多;而JAS長時間作用(24 h)，則可致細胞結構皺縮，微絲結構變得模糊不清，聚集成團塊狀?？赡艿臋C制為短時間JAS作用可誘導G-Actin聚合成F-Actin，即微絲，及競爭性結合F-Actin，穩(wěn)定微絲，而長時間的JAS作用則對細胞產生了毒性作用［9］。同時，我們在預實驗中選擇了3種濃度，分別為50、100及200 nmol·L－1，其中 50 nmol·L－1對細胞骨架影響不明顯，而200 nmol·L－1表現(xiàn)的則為毒性作用，因此在后續(xù)對HUVECs功能的研究中我們選擇的JAS的作用濃度為100 nmol·L－1，作用時間為1 h。

內皮細胞的功能很大程度上依賴于細胞的增殖、粘附、遷移及成血管等能力。就增殖而言，有研究表明細胞骨架的改變可以促進成骨細胞增殖［10］，但抑制內皮祖細胞的增殖［11］。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，JAS作用后，對HUVECs增殖的影響并不明顯。以上結果提示細胞骨架對細胞增殖的影響，在不同的細胞有所不同。

Fig 5 Effect of JAS on cell tube formation capability of HUVECs

另外，我們結果顯示，以JAS聚合細胞骨架后可增強HUVECs的黏附及遷移。細胞骨架中的肌動蛋白是維持細胞形態(tài)及細胞黏著的結構基礎［12］，培養(yǎng)細胞的黏著位點為黏附斑，其外部結構為整合素等蛋白。研究證實內皮細胞的黏附主要由細胞表面的整合素 α5β1 and αVβ3 調控［13］，因此 JAS 促進黏附的機制可能是細胞骨架聚合促進了細胞表面整合素β1及β3的表達。細胞遷移的主要過程為細胞外部信號引起細胞的極化，從而使細胞沿移動方向形成突起，細胞的突起與基底形成黏附，這些黏附點作為細胞收縮的支點。當細胞收縮時，細胞整體向前移動，細胞尾部與基底的黏附點得以釋放［14－16］。肌動蛋白參與了細胞突起的形成［17］，因此其對內皮細胞的遷移影響至關重要。類似于肌動蛋白在血小板的偽足形成、變形、收縮等生理過程中所起的重要作用［18］。細胞松弛素B和D被發(fā)現(xiàn)可通過抑制肌動蛋白聚合來抑制成纖維細胞、中性粒細胞和神經膠原瘤細胞的遷移［19－20］。JAS與細胞松弛素B和D的作用相反，是一種肌動蛋白聚合劑，與之對應的，本實驗結果表明肌動蛋白被JAS聚合后，HUVECs的遷移能力明顯增強。

內皮細胞在血管的完整性及血管的形成中起非常重要的作用，其成血管能力的強弱直接關系著新生血管的形成和血管的自身修復。為了研究細胞骨架對HUVECs成血管能力的影響，本實驗利用JAS促進微絲的聚合，改變肌動蛋白聚合、分離的動態(tài)變化過程。結果顯示，JAS可增強HUVECs的體外成血管能力。內皮細胞成血管能力主要受細胞增殖、黏附及遷移等多種因素的影響。JAS作用后盡管HUVECs的增殖沒有發(fā)生明顯的改變，但其黏附及遷移能力增強，這必將有助于HUVECs的體外成血管能力。

本實驗通過利用JAS促進微絲的聚合，初步探討了肌動蛋白細胞骨架對培養(yǎng)的HUVECs細胞生物特性的影響，發(fā)現(xiàn)JAS短時間預處理可穩(wěn)定細胞骨架，促進Actin骨架蛋白的聚合，進而提高HUVECs的黏附、遷移及體外成血管能力，但是細胞骨架在內皮細胞功能調控中的具體機制及相關的信號轉導是極其復雜的，有待進一步研究。

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