1-甲基海因?qū)σ钟舸笫笮袨閷W的影響及機制初探

游杰舒，張瑞睿，王春國，石晉麗，郭建友，史淑寧，候文慧，劉 勇

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029;2.中國科學院心理健康重點實驗室，中國科學院心理研究所，北京 100101)

抑郁癥是一種常見的情感性障礙，以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，且心境低落與其處境不相稱，嚴重者可出現(xiàn)自殺念頭和行為。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)計，到2020年抑郁癥將成為僅次于心血管病的全球第二大疾?。?］。目前一線的抗抑郁藥物主要作用于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，但這僅對30%的抑郁癥患者起作用［2］。探究抑郁癥的其他機制，尋求開發(fā)抗抑郁新藥已成為近年來研究的熱點。大量研究表明抑郁癥患者與下丘腦－垂體－腎上腺軸(HPA軸)密切相關(guān)，還有學者提出了“抑郁障礙的神經(jīng)營養(yǎng)假說”，認為抑郁癥是由于腦內(nèi)BDNF降低所引起的，抗抑郁藥可增加腦中BDNF含量，提高突觸的可塑性和促進神經(jīng)元的生存，從而改善抑郁癥狀［3］。

哈蟆油(Ranae Oviductus，RO)，為蛙科動物中國林蛙(Rana temporaria chensinensisDavid)雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制干燥而得，味甘、咸，性平，歸肺、腎經(jīng)，具補腎益精、養(yǎng)陰潤肺的功效，收載于2010年版《中國藥典》。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)哈蟆油石油醚部位和95%乙醇部位可能具有抗抑郁作用。有文獻報道稱1-甲基海因是從哈蟆油95%乙醇中分離得到的單體［4］，而且研究還發(fā)現(xiàn)［5］烷基取代海因類化合物作為鈉通道阻滯劑，可以用于治療和預(yù)防局部或全身缺血而造成的神經(jīng)功能喪失，以及退化性神經(jīng)紊亂，包括運動神經(jīng)元疾病、憂慮癥、癲癇癥等，還可用作抗心率失常藥、麻醉藥和抗躁狂藥，因此推測哈蟆油抗抑郁作用的有效成分可能是1-甲基海因。本研究通過化學合成得到1-甲基海因，用慢性冰水游泳應(yīng)激抑郁模型考察了其抗抑郁作用及相關(guān)機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD♂大鼠，初始體質(zhì)量200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號:SCXK(京)2007－0001。大鼠飼養(yǎng)于中國科學院心理研究所SPF級動物房，光照節(jié)律12 L∶12 D(7∶00～19∶00)，室溫(22±2)℃，動物可以自行攝取標準飼料和清潔飲用水，實驗前大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d，每天對其進行撫摸。實驗經(jīng)中國科學院心理研究所實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥品與試劑 ①1-甲基海因自制，并經(jīng)高效液相色譜與1-甲基海因標準品(中國藥品生物制品檢定所，111836)進行鑒定，純度達98%以上。臨用時將1-甲基海因與生理鹽水配成所需濃度的溶液。同時，空白組用生理鹽水作為對照。②鹽酸氟西汀(Fluoxetine，Prozac百憂解，禮來蘇州制藥有限公司，A333341)，用生理鹽水配成所需濃度的溶液，給藥容量1 ml/200 g，新鮮配制。③總蛋白提取試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)。④大鼠皮質(zhì)酮ELISA檢測試劑盒(R＆D，USA)。兔抗人BDNF多抗、山羊抗人β-肌動蛋白(β-actin)多抗和ECL發(fā)光底物顯色試劑盒(美國Sant Cruz公司);兔抗山羊IgG-HRP:北京中杉公司。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 DMS-2 Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)，高速冷凍離心機(Beckman Allegra 64R)，酶標儀(美國MULTISKAN EX PRIMARY EIA V.2.3)，UV-2800 紫外分光光度計(龍尼柯上海儀器有限公司)，垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 SD♂大鼠根據(jù)體重隨機分為6組，每組13只。①正常組:正常飼養(yǎng) +生理鹽水;②模型組:接受14 d冰水游泳應(yīng)激制備抑郁模型+生理鹽水;③陽性對照組:抑郁模型 +鹽酸氟西汀(10 mg·kg－1·d－1);④ 1-甲基海因低劑量組:抑郁模型 +1-甲基海因低劑量(20 mg·kg－1·d－1);⑤1-甲基海因中劑量組:抑郁模型+1-甲基海因中劑量(40 mg·kg－1·d－1);⑥ 1-甲基海因高劑量組:抑郁模型+1-甲基海因高劑量(80 mg·kg－1·d－1)。藥物配制濃度分別為4、8 和16 g·L－1，給藥量1 ml/200 g，每天1 次，連續(xù)14 d，在 d 14 1-甲基海因各劑量組和鹽水對照組末次給藥1 h后，鹽酸氟西汀組給藥0.5 h后，于8∶00～14∶00進行行為學測試。

2.2 慢性冰水游泳應(yīng)激大鼠模型 按照文獻方法［6］建立抑郁癥大鼠模型。除正常組外，其余各組每天8∶00～10∶00在2.0 ml×1.0 mW ×1.5 mH的水池中冰水游泳5 min，連續(xù)14 d。

2.3 體重檢測 分別于實驗第1、7和14天稱取大鼠體重。

2.4 蔗糖水消耗實驗 實驗前1 d禁水禁食22 h，于第1和14天分別測試2 h內(nèi)糖水消耗量以及水消耗量，計算糖水偏愛度(糖水偏愛度/%=糖水消耗量/總液體消耗量×100%)。

2.5 曠場實驗(open-field test) 用Morris水迷宮系統(tǒng)(由圓形水池、圖像自動采集和處理系統(tǒng)組成)進行大鼠曠場實驗。圓形水池為100 cm×100 cm×50 cm，四周底面全部涂黑的無蓋圓筒。實驗前讓大鼠自由探究5 min。正式實驗時，將大鼠放入曠場的邊緣區(qū)，采用視頻跟蹤分析系統(tǒng)自動記錄大鼠5 min的活動情況。觀察大鼠的運動距離和進入曠場中央(半徑33 cm的圓形區(qū)域)的時間百分比。

2.6 血清皮質(zhì)酮濃度的測定 行為學實驗結(jié)束后，立即斷頭取血，4 ℃ 3 000 r·min－1離心 15 min，取上清液于－20℃保存待測。用ELISA法檢測血清中皮質(zhì)酮含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，最后酶標儀上于450 nm波長測定吸光度(OD)值，以μg·L－1表示其含量。

2.7 蛋白免疫印跡分析 行為學實驗結(jié)束后，立即斷頭，在冰上取海馬組織，置－80℃保存?zhèn)溆?。大鼠海馬組織總蛋白提取按總蛋白提取試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)說明書操作，并用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定蛋白濃度。取總蛋白(50 μg)在SDS-PAGE凝膠上電泳分離2 h，將凝膠濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。取出PVDF膜，浸于封閉液中室溫輕搖封閉1 h，用TBST緩沖液漂洗干凈，浸入TBST稀釋的一抗(兔抗人BDNF抗體1∶2 000;山羊抗人β-actin抗體1∶2 000)，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min;再用TBS洗1次，10 min。同上方法準備二抗(兔抗山羊IgGHRP 1∶500)稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min;再用TBS洗1次，10 min。之后用ECL檢測試劑盒顯色，曝光、顯影和定影，將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

2.8 統(tǒng)計學分析 用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，結(jié)果以±s表示。實驗結(jié)果兩組比較采用雙側(cè)t檢驗，多組間比較先用單因素方差分析，差異有顯著性時再用Dunnett’t檢驗進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 1 -甲基海因?qū)σ钟裟Ｐ痛笫篌w重的影響 結(jié)果表明，各組在第1天和第7天大鼠體重均無差異(P＞0.05)。在第14天時，和空白組比較，模型組體重明顯下降(P＜0.01);和模型組比較，陽性藥組和1-甲基海因20，40 mg·kg－1劑量組均能明顯增加抑郁大鼠的體重(P＜0.05)。見Fig 1。

3.2 1 -甲基海因?qū)σ钟裟Ｐ痛笫笳崽瞧玫挠绊懡Y(jié)果表明，各組在第1天蔗糖偏愛度無差異(P＞0.05)。在第14天時，和空白組比較，模型組大鼠蔗糖偏愛度明顯下降(P＜0.05);和模型組比較，陽性組和1-甲基海因各劑量組均能明顯增加抑郁大鼠的蔗糖偏愛度(P＜0.05)。見Fig 2。

Fig 1 Effect of 1-methylhydantoin on body weight in rats(±s，n=13)

Fig 2 Effect of 1-methylhydantoin on sucrose preference in rats( ± s，n=13)

3.3 1 -甲基海因?qū)σ钟裟Ｐ痛笫髸鐖鰧嶒灥挠绊懡Y(jié)果表明，在第14天時，和空白組比較，模型組大鼠的運動距離明顯下降(P＜0.01)，陽性藥組和1-甲基海因20，40 mg·kg－1劑量組能明顯增加抑郁大鼠的運動距離(P＜0.05)。和空白組比較，模型組大鼠進入中央?yún)^(qū)時間百分比明顯下降(P＜0.05)，陽性藥組和1-甲基海因各劑量組有增加大鼠進入中央?yún)^(qū)時間百分比的趨勢，但結(jié)果不明顯(P＞0.05)。見 Tab 1。

3.4 1 -甲基海因?qū)σ钟裟Ｐ痛笫笱迤べ|(zhì)酮的影響 結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠血清中皮質(zhì)酮的含量增加(P＜0.01);和模型組相比，陽性藥組和1-甲基海因各劑量組均能降低皮質(zhì)酮的水平(P＜0.05)。見 Fig 3。

Tab 1 Effect of 1-methylhydantoin on the open-field test in rats(±s，n=13)

Tab 1 Effect of 1-methylhydantoin on the open-field test in rats(±s，n=13)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs chronic forced swim stress group

Group Dose/mg·kg－1 Total distance/cm Percentage of time spent in central area/%_____Control / 4117.03 ±128.22 6.07 ±1.53 Stress / 3483.29±229.61＊＊ 2.34±0.57＊＊Fluoxetine 10 4018.85 ±129.94# 2.70 ±0.54 1-methylhydantoin 20 3964.49 ±139.78# 3.00 ±0.55 40 4087.08 ±89.57# 3.47 ±0.66________________80___________3766_____________________________.45__±216.74__3.51__±0.35

Fig 3 Effect of 1-methylhydantoin on the corticosterone levels in rats(±s，n=13)

3.5 1 -甲基海因?qū)σ钟裟Ｐ痛笫蠛ｑRBDNF蛋白表達的影響 結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠海馬BDNF蛋白表達降低(P＜0.01);和模型組相比，1-甲基海因20和40 mg·kg－1劑量組均能增加BDNF蛋白的表達 (P＜0.01)。見Fig 4。

4 討論

慢性冰水游泳應(yīng)激是我們實驗室常用的抑郁模型之一。前期實驗已經(jīng)證實［6－8］該模型能夠引起動物的體重下降，曠場實驗中活動減少，蔗糖偏愛度減少，這些與人的抑郁狀態(tài)(如體重減少、對事物失去興趣、絕望、快感缺失等)相似。因此，本實驗采用慢性冰水游泳應(yīng)激建立大鼠抑郁模型，觀察1-甲基海因?qū)Υ笫笠钟粜袨榈挠绊懠捌渥饔脵C制。實驗結(jié)果表明，慢性冰水游泳應(yīng)激可致大鼠產(chǎn)生抑郁行為，1-甲基海因40 mg·kg－1能明顯改善大鼠的體重下降，增加糖水偏愛度以及增加大鼠在曠場中的運動距離，這說明1-甲基海因具有明確的抗抑郁作用，且在40 mg·kg－1的劑量下抗抑郁效果最佳，并且與其降低皮質(zhì)酮水平及增加BDNF的表達程度相一致。1-甲基海因?qū)β员斡緫?yīng)激大鼠的抗抑郁作用不具有典型的劑量依賴性，我們前期進行的蛤蟆油提取物抗抑郁藥理實驗中也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象［9］。這可能是因為高劑量1-甲基海因或代謝產(chǎn)物具有肝藥酶誘導劑的作用，加快藥物分解代謝，使其失去藥理活性所致［10］。

Fig 4 Effect of 1-methylhydantoin on BDNF levels in hippocampus of rats(±s，n=13)

下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸系統(tǒng)是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的一個重要分支，在應(yīng)激狀態(tài)時促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)分泌增多，進而影響促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的分泌，后者又能引起皮質(zhì)酮(CORT)分泌增加，使HPA軸過度活化［11］。臨床研究也表明，抑郁癥患者的HPA軸功能失調(diào)，血清中皮質(zhì)醇(人體內(nèi)為皮質(zhì)醇，動物為皮質(zhì)酮)水平升高，皮質(zhì)醇水平可反映抑郁癥的嚴重程度［12］。作者研究發(fā)現(xiàn)，慢性冰水游泳應(yīng)激性引起的HPA軸亢進，表現(xiàn)為血清皮質(zhì)酮水平增加，而1-甲基海因能明顯降低大鼠血清皮質(zhì)酮的含量，提示1-甲基海因的抗抑郁作用可能是通過調(diào)節(jié)HPA軸功能來實現(xiàn)的。

BDNF與HPA軸存在著廣泛的相互作用，海馬是他們之間最主要的相互作用部位。應(yīng)激引起海馬神經(jīng)元損傷可能是中樞許多應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)節(jié)點，保護中樞神經(jīng)元，尤其是海馬神經(jīng)元免受傷害，是防治應(yīng)激相關(guān)疾病的重要措施之一［13］。抑郁癥病人海馬結(jié)構(gòu)受損，體積較正常人減小，這可能是由于高皮質(zhì)醇導致興奮性氨基酸堆積，從而引起海馬神經(jīng)元萎縮、丟失、死亡。而BDNF作為最早發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，它可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元和突觸的可塑性，對中樞神經(jīng)元的增殖和修復有重要的意義［14］。本實驗結(jié)果也表明，慢性冰水游泳應(yīng)激抑郁大鼠海馬區(qū)BDNF的水平明顯降低，1-甲基海因治療后能上調(diào)慢性應(yīng)激抑郁引起的大鼠BDNF水平下降。

HPA軸的異常和基礎(chǔ)是CRF分泌過多，導致ACTH分泌也異常增高。沒有檢測皮質(zhì)和海馬中的CRF、ACTH含量，這是本次實驗的主要不足之處。但慢性應(yīng)激性引起的HPA軸亢進、CRF和ACTH分泌增高主要影響腎上腺，導致腎上腺皮質(zhì)CORT分泌增加。因此，CORT水平可以直接反映HPA軸的興奮性。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠，血清中CORT水平升高，提示HPA興奮性異常升高，這也與其他的研究相一致［15］。目前測定抑郁癥模型大鼠皮質(zhì)和海馬皮質(zhì)酮含量的研究較少，這可能由于HPA軸興奮后導致腎上腺分泌的皮質(zhì)酮主要進入血液，導致血液中皮質(zhì)酮含量升高，因此本文中我們也只檢測了血液中的皮質(zhì)酮水平。

綜上所述，1-甲基海因?qū)β员斡疽钟舸笫缶哂锌挂钟糇饔?，其作用機制可能與HPA軸功能狀態(tài)以及BDNF密切相關(guān)。1-甲基海因?qū)PA軸功能的調(diào)節(jié)作用還有待于進一步的研究。

［1］Murray CJL，Lopez A D.The Global Burden of Disease:a comprehensive assessment of mortality and disability from disease，inguries，and risk factors in 1990 and projected to 2020［M］.Cambridge，MA:Harvard University Press，1996:28.

［2］McNally L，Bhagwagar Z，Hannestad J.Inflammation，glutamate，and glia in depression:a literature review ［J］.CNS Spectr，2008，13:501－10.

［3］Duman R S，Monteggia L M.A neurotrophic model for stress related mood disorders［J］.Biol Psychiatry，2006，59(12):1116－27.

［4］王永生，張 輝，林 喆，王 哲.RP-HPLC測定哈蟆油中1-甲基海因的含量［J］.中國藥學雜志，2002，43(2):146－8.

［4］Wang YS，Zhang H，Lin Z，Wang Z.Study on determination of 1-methylhydantoin in oviductus ranae by RP-HPLC assay［J］.Chin Pharm，2002，43(2):146－8.

［5］白雪媛，楊椏楠，王永生.海因類化合物的藥理作用進展［J］.中成藥，2006，28(10):1512－4.

［5］Bai X Y，Yang Y N，Wang Y S.Pharmacological progress of hydantoin compounds［J］.Chin Tradit Pat Med，2006，28(10):1512－4.

［6］Qi X L，Lin W J，Li J F，et al.The depressive-like behaviors are correlated with decreased phosphorylation of mitogen-activated protein kinases in rat brain following chronic forced swim stress［J］.Behav Brain Res，2006，175:233－40.

［7］Qi X L，Lin W J，Li J F，et al.Fluoxetine increases the activity of the ERK-CREB signal system and alleviates the depressive-like behavior in rats exposed to chronic forced swim stress［J］.Neurobiol Dis，2008，31(2):278－85.

［8］Kitamura Y，Araki H，Nagatani T，et al.Influence of imipramine on the duration of immobility in chronic forced-swim-stressed rats［J］.Acta Med Okayama，2004，58(6):271－4.

［9］游杰舒，石晉麗，張碩峰，等.哈蟆油石油醚提取物抗抑郁作用的研究［J］.中國實驗方劑學雜志(印刷中)

［9］You J S，Shi J L，Zhang S F，et al.Antidepressant effects of petroleum ether extracts from Ranae Oviductus［J］.Chin J Exper Tradit Med Formu(in press)

［10］張仲一，高 嵐，路 軍.中藥量效關(guān)系動物實驗觀察［J］.天津中醫(yī)學院學報，1994，6(3):31－2.

［10］Zhang Z Y，Gao L，Lu J.Animal experimental observations of TCM dose-effect relationship［J］.J Tianjin Coll Tradit Chin Med，1994，6(3):31－2.

［11］郭秋平，高 英，李衛(wèi)民.百合皂苷對抑郁模型大鼠HPA軸的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(5):699－700.

［11］Guo Q P，Gao Y，Li W M.Influence of the lilium saponins on HPA axis of the depression model rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(5):699－700.

［12］Van Den Eede F，Claes S J.Mechanisms of depression:role of HPA axis［J］.Drug Discov Today:Disease Mechanisms，2004，1(4):413－8.

［13］吳麗麗，嚴 燦，丁勝元，等.加味四逆散抗應(yīng)激性抑郁效應(yīng)及其海馬NMDA受體通道機制的初步研究［J］.中國藥理學通報，2007，23(11):1425－31.

［13］Wu L L，Ding C，Ding S Y，et al.The initial research on the effect of anti-stressed depression of Jiaweisinisan and its mechanism of N-methyl-D-aspartate receptor channel in hippocampus［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(11):1425－31.

［14］Liu W N，Zhou C L.Corticosterone reduces brain mitochondrial function and expression of mitofusin，BDNF in depression-like rodents regardless of exercise preconditioning［J］.Psychoneuroendocrinology，2012，37:1057－70.

［15］劉麗琴，羅 艷，張瑞睿，郭建友.人參皂苷對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學及HPA軸、BDNF的影響［J］.中國中藥雜志，2011，36(10):3142－7.

［15］Liu L Q，Luo Y，Zhang R R，Guo J Y.Effects of ginsenosides on hypothalamic-pituitary-adrenal function and brain derived neurotrophic factor in rats exposed to chronic unpredictable mild stress［J］.China J Chin Mater Med，2011，36(10):3142－7.