OxyR蛋白對不同應(yīng)激條件下傷寒沙門菌生存能力的影響

詹莉芳，張曉磊，翁曉琴，張海方，徐順高，黃新祥

(江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一種重要的人類腸道致病菌，能引起全身性感染。S.Typhi從外界進(jìn)入人體時(shí)，需要適應(yīng)宿主體內(nèi)酸、堿、滲透壓、氧和營養(yǎng)等環(huán)境的變化［1］。多種代謝途徑及環(huán)境中活性氧的累積，可對細(xì)菌的生理代謝、蛋白質(zhì)、膜脂質(zhì)及核酸等物質(zhì)造成一系列的損傷［2］。oxyR(過氧化氫誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)活化因子)基因最初在鼠S.Typhi和大腸埃希菌(E.coli)中被報(bào)道，其表達(dá)蛋白OxyR可以監(jiān)測活性氧的產(chǎn)生，并且通過上調(diào)40多種基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)菌的生理代謝［3］，但在S.Typhi中關(guān)于 OxyR 的研究還未見報(bào)道。本研究擬構(gòu)建S.Typhi oxyR基因缺陷株以及oxyR基因缺陷回補(bǔ)株，通過對其在不同應(yīng)激下生長曲線的分析，以及熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測氧化應(yīng)激相關(guān)的亞鐵螯合酶(hemH)基因和甘露糖酸脫水酶(uxuA)基因的表達(dá)量，研究OxyR蛋白對細(xì)菌生存能力的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 野生型 S.Typhi GIFU 10007由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈(zèng);E.coli DH5α、質(zhì)粒 pET28a(Kanr)、質(zhì)粒 pBAD/gⅢ由本室保存;質(zhì)粒pKD46由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑與材料 Ex Taq和r Taq DNA聚合酶、XhoⅠ和 EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、dNTP、DL 2 000 DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物、T4DNA連接酶、qRT-PCR試劑盒均為TaKaRa公司(大連)產(chǎn)品;Pfu DNA聚合酶、RNA酶為Fermentas公司產(chǎn)品，L-阿拉伯糖、氨芐西林、卡那霉素為Sigma公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 恒溫?fù)u床(Thermo scientific);PCR擴(kuò)增儀2720 Thermal Cycler(ABI);凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene);核酸檢測儀Speetrophotometer ND-100(NanoDrop);電轉(zhuǎn)化儀Gene Pulsero II(Bio-Rad);超速冷凍離心機(jī)5417R(Eppendorf);金屬浴(Grant-bio);分光光度計(jì)Bio Photometer(Eppendorf);實(shí)時(shí)定量PCR儀CFX96TM(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本室測定的 S.Typhi野生株GIFU 10007基因組序列信息(未公布)和pET28a(Kanr)序列信息，利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)oxyR缺陷株、oxyR缺陷株驗(yàn)證、oxyR缺陷回補(bǔ)株及qRTPCR引物。

(1)oxyR缺陷株引物設(shè)計(jì)(圖1):依據(jù)GIFU 10007基因序列顯示，oxyR編碼基因全長918 bp，分別設(shè)計(jì)2對引物L(fēng)1-Kl/R1-Kr，L2/R2產(chǎn)生89 bp上下游同源臂，用于敲除oxyR基因全部的開放閱讀框。

(2)oxyR缺陷株驗(yàn)證引物V-L/V-R設(shè)計(jì)(圖1):V-L來自基因序列中上游同源臂外側(cè)一段16 bp的序列，V-R來自卡那霉素抗性基因中一段16 bp的序列。

(3)oxyR缺陷回補(bǔ)株引物設(shè)計(jì):在oxyR基因上下游設(shè)計(jì)引物L(fēng)3/R3，并在5'端分別加上XhoⅠ及EcoRⅠ酶切位點(diǎn)用以連接pBAD/gⅢ載體。

(4)qRT-PCR引物設(shè)計(jì):根據(jù)GIFU 10007基因組中的uxuA、hemH基因序列，各自設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增片段長度為150 bp左右的特異性引物，通過qRT-PCR來檢測這兩個(gè)基因的表達(dá)情況。所有引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見表1。

1.2.2 Red重組功能的誘導(dǎo)和感受態(tài)細(xì)胞的制備將編碼Red重組系統(tǒng)的質(zhì)粒pKD46電擊轉(zhuǎn)化至S.Typhi野生株中，篩選陽性克隆，作為下一步轉(zhuǎn)化的宿主菌，命名為007-pKD46。挑取007-pKD46單菌落接種于1 mL等滲LB培養(yǎng)液中，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1∶100的比例轉(zhuǎn)種至20 mL等滲LB培養(yǎng)液中，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)至D(600 nm)為0.6，并在培養(yǎng)終止前1 h加入L-阿拉伯糖(終濃度為1 mmol/L)誘導(dǎo)Red系統(tǒng)重組蛋白的表達(dá)。離心，收集菌體，用冰浴無菌水漂洗3次，再用10%的無菌甘油漂洗1次，最后將菌體重懸，取50 μL用于電擊轉(zhuǎn)化。

1.2.3 S.Typhi oxyR 缺陷株的制備 S.Typhi oxyR基因缺陷變異株根據(jù)文獻(xiàn)［4］制備，主要步驟見圖2。以環(huán)狀質(zhì)粒pET28a(Kanr)為模板，用特異性引物L(fēng)1-Kl/R1-Kr擴(kuò)增出帶有oxyR基因上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片段F1。然后以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，用L2/R2引物擴(kuò)增出延長了同源臂的片段F2。取2 μg經(jīng)酚-氯仿純化后的F2電擊轉(zhuǎn)化入007-pKD46中，37℃倒置過夜培養(yǎng)后，檢測轉(zhuǎn)化子的生長狀況，然后用菌落進(jìn)行PCR(引物VL/V-R)，篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子即為oxyR基因缺陷株，命名為ΔoxyR。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of primers

圖2 Red重組系統(tǒng)基因敲除原理示意圖Fig 2 The schematic diagram of Red recombination system for gene knocking out

1.2.4 S.Typhi oxyR基因缺陷回補(bǔ)株的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［5］制備，在S.Typhi野生株oxyR基因上下游設(shè)計(jì)引物L(fēng)3/R3，并在5'端分別加上 XhoⅠ及EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，以S.Typhi野生株GIFU 10007的基因組DNA為模板，用高保真的Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增出目的片段，酚-氯仿純化后由XhoⅠ及EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，通過T4DNA連接酶將其與經(jīng)同樣酶切的pBAD/gⅢ質(zhì)粒16℃連接2 h。用熱擊法將酶接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，篩選陽性克隆并用酶切和PCR進(jìn)行初步鑒定，再用DNA測序分析驗(yàn)證(測序由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成)。陽性克隆質(zhì)粒和空質(zhì)粒pBAD/gⅢ分別電擊導(dǎo)入ΔoxyR變異株中，命名為ΔoxyR+pBAD-oxyR，ΔoxyR+pBAD。

1.2.5 生長曲線 分別挑取 S.Typhi野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒株單菌落于1 mL等滲LB培養(yǎng)液中，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜;過夜細(xì)菌以1∶100分別轉(zhuǎn)種于新配制的、預(yù)熱的等滲液(NaCl 150 mmol/L)、高滲液(NaCl 300 mmol/L)、酸(pH=4.2)及氧(4 mmol/L H2O2)的LB培養(yǎng)液中，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h用分光光度計(jì)檢測D(600 nm)值并記錄，直至24 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以D(600 nm)值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)制作生長曲線，分別比較4種菌株在不同環(huán)境下的生長狀況。

1.2.6 總 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與 qRT-PCR 分別提取S.Typhi野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒株在對數(shù)期氧應(yīng)激下的總RNA。細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)期后給予氧應(yīng)激(4 mmol/L H2O2)30 min后，用Trizol法提取 RNA并消化殘余DNA?？俁NA提取后用隨機(jī)引物N8反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系:4 μg 總 RNA，4 μL N8，1 μL dNTP 和6.7 μL DEPC 處理水，混合后 65 ℃ 1min，冰上迅速冷卻后加入 4 μL 5 × 反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.1 μL RNA 酶抑制劑，0.2 μL 反轉(zhuǎn)錄酶，總體積 20 μL;反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:25℃10 min，50℃ 50 min，70℃15 min。之后按TaKaRa公司的qRT-PCR試劑盒操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次均設(shè)平行對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S.Typhi oxyR基因缺陷變異株的制備

以pET28a(Kanr)環(huán)狀質(zhì)粒DNA為模板，L1-Kl為5'端引物，R1-Kr為3'端引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物F1。以F1片段為模板，L2/R2為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物F2。在含卡那霉素(終濃度為50 mg/L)的普通LB平板上培養(yǎng)后，篩選陽性克隆，以V-L和V-R為引物進(jìn)行PCR，均得到相同的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致，證實(shí)ΔoxyR基因缺陷株制備成功。見圖3。

圖3 S.Typhi oxyR基因缺陷變異株的制備Fig 3 Preparation of the oxyR deleted mutant of S.Typhi

2.2 S.Typhi oxyR基因缺陷回補(bǔ)株的制備

以野生株基因組DNA為模板，用引物L(fēng)3/R3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得oxyR基因回補(bǔ)片段。將擴(kuò)增目的片段經(jīng)雙酶切后與同樣雙酶切后的表達(dá)載體pBAD/gⅢ進(jìn)行連接，熱擊導(dǎo)入E.coli DH5α中，獲得陽性初篩菌，將疑似陽性克隆進(jìn)行酶切和PCR鑒定。經(jīng)DNA測序分析顯示，插入的回補(bǔ)片段與目的基因完全一致，說明含oxyR基因的載體成功轉(zhuǎn)入缺陷株中，S.Typhi oxyR基因缺陷回補(bǔ)株制備成功。見圖4。

2.3 不同菌株在不同應(yīng)激條件下的生長能力

S.Typhi野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒株在等滲、酸、氧及高滲環(huán)境中的生長狀況，如圖5所示。生長曲線分析結(jié)果顯示，在等滲、酸、高滲環(huán)境中，oxyR缺陷株的生存能力與野生株比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而在氧應(yīng)激條件下，oxyR缺陷株的生存能力明顯低于野生株(P＜0.05)。在各種條件下，回補(bǔ)株的生存能力恢復(fù)達(dá)到野生株水平，而回補(bǔ)空質(zhì)粒菌株的生存能力與缺陷株比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明pBADg/Ⅲ載體對菌株的生存能力無明顯影響。

圖4 傷寒沙門菌oxyR基因缺陷回補(bǔ)株的制備Fig 4 Rescue of oxyR in the oxyR deleted mutant of S.Typhi

圖5 不同菌株在不同應(yīng)激條件下的生長曲線Fig 5 Growth curve analysis of different strains in different stressive conditions

2.4 qRT-PCR分析氧化調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)

為進(jìn)一步探討OxyR對S.Typhi氧化調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的影響，我們分別提取了S.Typhi野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒株在對數(shù)期給予氧應(yīng)激后的總RNA，并用qRT-PCR分析4種菌株中uxuA、hemH基因的mRNA水平。如圖6所示，氧應(yīng)激時(shí)，與野生株相比，oxyR缺陷株中uxuA基因mRNA的水平顯著升高(P＜0.01)、hemH基因mRNA的水平顯著降低(P＜0.01);與此同時(shí)，缺陷回補(bǔ)株uxuA基因和hemH基因的表達(dá)水平與空質(zhì)粒株相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖6 氧應(yīng)激時(shí)不同菌株中氧化調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)Fig 6 Expression of oxidative stress-related genes in different strains

3 討論

近年來關(guān)于OxyR參與基因表達(dá)調(diào)控的報(bào)道越來越多，在許多革蘭陽性和陰性菌中均可檢測到OxyR。其在細(xì)菌的多種代謝活動(dòng)中都起著重要的作用，包括氧化應(yīng)激損傷、細(xì)菌毒力、生物膜形成、定植以及菌毛合成等［6-9］。

OxyR是轉(zhuǎn)錄因子亮氨酸家族中的一種蛋白［10］，在氨基末端有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)域，羧基末端有參與調(diào)解寡聚反應(yīng)的基序。當(dāng)細(xì)菌處于氧應(yīng)激環(huán)境中，OxyR被氧化，蛋白分子內(nèi)的2個(gè)半胱氨酸殘基(Cys199和Cys208)形成二硫鍵，進(jìn)而結(jié)合到特定靶基因的調(diào)控區(qū)域發(fā)揮作用［11］。OxyR作為一種抗氧化調(diào)節(jié)蛋白，在E.coli中，既可以作為過氧化物探測器，又可以激活相關(guān)基因的表達(dá)，包括dps(一種在營養(yǎng)缺乏條件下產(chǎn)生的DNA結(jié)合蛋白)、garA(GSH還原酶)、grxA(谷氧還原蛋白)、katG(過氧化氫酶)、aphCF(NADPH氧化還原酶類)以及fur(Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)蛋白)等基因［12］。此外，E.coli的OxyR激活還可以促進(jìn)OxyS的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)20多種基因的表達(dá)［13］。然而，OxyR并非總是作為激活劑調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［14］。在奈瑟菌屬中，當(dāng)不存在氧化應(yīng)激時(shí)，OxyR則抑制過氧化氫酶的表達(dá);當(dāng)存在氧化應(yīng)激時(shí)，如受到過氧化物的刺激，則作為激活劑促進(jìn)過氧化氫酶的表達(dá)。白喉棒狀桿菌的OxyR與E.coli相比，具有52%的同源性，也含有監(jiān)測過氧化物的2個(gè)半胱氨酸，但是作為cat(過氧化物酶)基因表達(dá)的抑制劑，其作用的發(fā)揮不依賴過氧化物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激［15］。

在本研究中，我們利用λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了S.Typhi oxyR基因缺陷株，為研究OxyR蛋白在S.Typhi中的作用奠定了基礎(chǔ)。我們通過胞外應(yīng)激條件研究了S.Typhi OxyR對細(xì)菌生存能力的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)菌處于氧應(yīng)激時(shí)，oxyR缺陷株的存活能力明顯下降。qRT-PCR結(jié)果表明，OxyR蛋白激活hemH基因的表達(dá)而抑制uxuA基因的表達(dá)。HemH參與血紅素的生物合成，并且是過氧化氫酶(katG和katE)合成的輔助因子［12］;UxuA是細(xì)菌磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)途徑的重要組分。以上結(jié)果提示，S.Typhi在氧應(yīng)激時(shí)，OxyR可能作為一種調(diào)控因子，直接或間接地激活或抑制一些基因的表達(dá)，來對抗所受到的應(yīng)激。關(guān)于S.Typhi OxyR發(fā)揮作用的具體機(jī)制以及是否有更多的基因受到調(diào)節(jié)，還有待進(jìn)一步研究。

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