褪黑素受體MT1 和轉(zhuǎn)錄因子Sp1 在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

曾建，陳麗萍，陳淼，陳艷，許豪勤，狄榮科

(1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013;2.鎮(zhèn)江市人口與計(jì)劃生育委員會(huì)，江蘇 鎮(zhèn)江212001)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害患者生命健康。褪黑素是一種主要由松果體合成并分泌的吲哚類激素，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)生物節(jié)律、參與免疫調(diào)節(jié)等多種功能［1]。近年來，人們?cè)絹碓疥P(guān)注褪黑素對(duì)乳腺癌的抑制作用。Sanchez-Barcelo 等［2]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以通過褪黑素受體1(melatonin receptor，MT1)途徑降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，阻斷雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制雌激素受體(ER)α 陽性乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Collins等［3]研究顯示，MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中MT1 的表達(dá)有助于褪黑素的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，MT1 表達(dá)水平越高，褪黑素的抗腫瘤增殖作用越強(qiáng)。

轉(zhuǎn)錄因子Sp1(transcription factor Sp1)是一種DNA 結(jié)合蛋白，通過調(diào)控富含GC/TC 序列的啟動(dòng)子的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種功能的調(diào)節(jié)［4]。Maor 等［5]指出，ER 通過與轉(zhuǎn)錄因子Sp1相互作用，調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖。本研究旨在檢測(cè)MT1 和Sp1 在乳腺癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性，探討兩者在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用機(jī)制，為乳腺癌惡性程度的判斷和預(yù)后評(píng)估提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本和資料來源

收集2011年1月至2012年6月在鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院行乳腺癌根治手術(shù)的90例乳腺癌標(biāo)本，50例癌旁正常乳腺組織(距癌組織5 cm 以上)，每例標(biāo)本于手術(shù)取材后立即凍存于液氮中。樣本均取自女性患者，年齡33 ～84 歲，平均53.6 歲，所有患者術(shù)前均未接受放、化療及其他治療。制備的病理切片均經(jīng)兩位以上副高職稱的臨床病理醫(yī)師診斷確認(rèn)。其中，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌68例，乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌22例;局部腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無轉(zhuǎn)移49例。按照2003年WHO 分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(根據(jù)腺腔形成、核的多形性、每10 個(gè)高倍視野的核分裂相計(jì)數(shù))進(jìn)行診斷和分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)17例，Ⅱ級(jí)32例，Ⅲ級(jí)41例。

1.2 主要試劑

兔抗人MT1 多隆抗體(bs-0027R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，工作液濃度為1 ∶100;兔抗人Sp1 多克隆抗體(No. SC-59 )和β-肌動(dòng)蛋白購自美國(guó)Santa Cruz 公司，工作液濃度為1 ∶150。蛋白預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)參照物購自美國(guó)Fermenta 公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新試劑公司，RIPA 組織裂解液、DAB 顯色劑購自武漢博士徳公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)SP 法 所有標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋，然后3 μm 連續(xù)切片、脫蠟、水化，PBS 洗滌。采用高溫?zé)嵝迯?fù)法修復(fù)抗原;分別滴加50 μL 一抗，陰性對(duì)照用PBS 代替一抗，4℃濕盒孵育過夜;PBS 洗滌;分別滴加50 μL HRP標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min;PBS 充分洗滌;DAB 顯色5 ～10 min，流水沖洗;蘇木素復(fù)染、藍(lán)化、脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡 取液氮中保存的乳腺癌組織(癌組織占所取總組織的80%以上)和癌旁正常乳腺組織，用RIPA 組織裂解液提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后分裝樣品，于-80 ℃保存。每例標(biāo)本取總蛋白20 μg，加5 μL 蛋白預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)參照物作為標(biāo)準(zhǔn)參照，經(jīng)10%SDS-PAGE 電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，觀察預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)參照物的轉(zhuǎn)移效果，判斷樣品的轉(zhuǎn)移效果，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)雜交信號(hào)，UPV 掃描儀掃描成像。

1.4 結(jié)果判斷

MT1 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，Sp1 蛋白主要定位于細(xì)胞核，出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。在光鏡下觀察，按陽性細(xì)胞所占比例及分布情況記錄如下:陰性(-)，即所有細(xì)胞中均沒有染色;弱陽性(+)，即局灶性陽性著色細(xì)胞數(shù)＜10%;中度陽性(++)，即陽性著色細(xì)胞數(shù)為10% ～50%;強(qiáng)陽性(+++)，即陽性著色細(xì)胞數(shù)≥50%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和方差分析以及Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MT1、Sp1 在乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，乳腺癌組織、癌旁正常乳腺組織均表達(dá)MT1、Sp1 蛋白，且乳腺癌中MT1、Sp1蛋白的表達(dá)均高于其在癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)(圖1)，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致(圖2)。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MT1 和Sp1 在不同乳腺組織中的表達(dá)Fig 1 Western blotting results of MT1 and Sp1 expressions indifferent breast tissues

MT1 在乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中的陽性表達(dá)率分別為64. 4% (58/90)，22. 0% (11/50)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Sp1在乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中的陽性表達(dá)率分別為74.4%(67/90)，28.0%(14/50)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

2.2 MT1、Sp1 的表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

乳腺癌組織中MT1、Sp1 的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小及組織學(xué)分級(jí)無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而與腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān)(P＜0.05)，見表2。

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MT1 和Sp1 在不同乳腺組織中的表達(dá)(SP×200)Fig 2 Immunohistochemistry analysis of the expressions of MT1 and Sp1 in breast tissues

表1 乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中MT1 和Sp1 的表達(dá)Tab 1 The expressions of MT1 and Sp1 in breast cancer tissues and adjacent normal breast tissues

表2 MT1、Sp1 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 The relationship between expressions of MT1 and Sp1 and clinicopathologic characteristics of breast cancer

2.3 乳腺癌組織中MT1、Sp1 表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析，乳腺癌組織中MT1與Sp1 的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.523，P＜0.01)。見表3。

表3 乳腺癌組織中MT1 與Sp1 表達(dá)的相關(guān)性Tab 3 The correlation of MT1 and Sp1 expressions in breast cancer tissues

3 討論

褪黑素受體為G 蛋白偶聯(lián)受體，在人體內(nèi)主要有MT1 和MT2 亞型，其功能尚不完全明確。MT2主要調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、血管舒張、機(jī)體免疫等功能，MT1 主要調(diào)節(jié)生殖、代謝、血管收縮、腫瘤細(xì)胞增殖等功能［6]。本研究結(jié)果顯示，MT1 在癌旁正常乳腺組織中低表達(dá)(22. 0%)，在乳腺癌組織中高表達(dá)(74.4%)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。MT1 在乳腺癌組織中，大多呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在癌旁正常乳腺組織中，表達(dá)全部呈陰性或弱陽性。該現(xiàn)象表明，MT1 編碼基因在乳腺癌的發(fā)生過程中可能被激活，從而呈高表達(dá)。本研究還顯示，MT1 在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤大小、患者年齡、組織學(xué)分級(jí)無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而與腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期呈正相關(guān)(P＜0.05)，可見乳腺癌生物性越活躍，MT1 表達(dá)程度越強(qiáng)，這可能與MT1 調(diào)節(jié)惡性腫瘤增殖有關(guān)［7]。Dillon 等［8]研究MT1 在乳腺癌中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，腫瘤惡性程度越高，MT1 表達(dá)水平越高，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Yuan 等［9]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中MT1 受體表達(dá)水平越高，腫瘤細(xì)胞對(duì)褪黑素敏感性越強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中MT1 的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常乳腺組織，且與腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移相關(guān)。這提示MT1 可作為乳腺癌術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)判斷指標(biāo)之一，推測(cè)如果檢測(cè)到乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞中MT1 呈高表達(dá)，則提示復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較大，預(yù)后可能較差。同時(shí)MT1 在乳腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)，為外源性褪黑素與乳腺癌結(jié)合提供了可供利用的靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究外源性褪黑素在治療乳腺癌中的應(yīng)用提供了依據(jù)。Mao 等［10]研究也發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過受體MT1 抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲，可能是通過特異性下調(diào)p38MAPK 通路，抑制MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)及活化而實(shí)現(xiàn)的。正常人體內(nèi)褪黑素的分泌水平隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸下降［11]，MT1 的表達(dá)與褪黑素的分泌水平呈負(fù)相關(guān)，褪黑素分泌越少，MT1 表達(dá)越多［8]。此外，Karasek 等［12]研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者血清中的褪黑素水平較低。本研究中乳腺癌組織中MT1 異常高表達(dá)的原因可能是乳腺癌患者血清中褪黑素水平極低，無法與MT1 全部結(jié)合內(nèi)化，從而導(dǎo)致MT1 異常堆積于乳腺癌細(xì)胞膜上。

Sp1 是具有鋅指結(jié)構(gòu)的一種核受體家族轉(zhuǎn)錄因子，含有A、B、C、D 4 個(gè)結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于幾乎所有組織的細(xì)胞核中［13]。轉(zhuǎn)錄因子Sp1 通過多種途徑，如翻譯后修飾、與其他蛋白結(jié)合等，影響其轉(zhuǎn)錄活性［14]。同時(shí)，Sp1 的激活與高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移，可能是通過上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子及血管生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等基因的表達(dá)，改善了腫瘤周圍局部微環(huán)境的結(jié)果［15]。Maor 等［5]研究結(jié)果顯示，Sp1 通過與ERα 相互作用，調(diào)節(jié)乳腺腫瘤細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 受體基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而促進(jìn)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖。此外，Sp1 也在其他多種腫瘤組織中高表達(dá)。Jia 等［16]研究發(fā)現(xiàn)，Sp1 在人胰腺癌細(xì)胞中異?；罨?，上調(diào)了腫瘤細(xì)胞中VEGF 的表達(dá)，從而促進(jìn)了腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Wang等［17]研究表明，胃癌組織中Sp1 的高表達(dá)與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是胃癌患者預(yù)后不良的因素之一。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Sp1 的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常乳腺組織，說明Sp1 的異常表達(dá)可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起一定促進(jìn)作用。此外，Sp1 在TNM 分期Ⅲ-Ⅳ期患者中的陽性表達(dá)率高于TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期患者(P＜0.05)，在伴有癌組織浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的陽性表達(dá)率分別高于無癌組織浸潤(rùn)和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.01)，與王曉冰等［18]研究結(jié)果一致，提示Sp1 的異常表達(dá)可作為判斷乳腺癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)程的一項(xiàng)分子指標(biāo)。

本研究顯示，乳腺癌組織中MT1 的表達(dá)與Sp1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.523，P＜0.01)，表明兩者在乳腺癌組織中的表達(dá)趨勢(shì)相一致，提示其可能共同參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌患者中，高表達(dá)的Sp1 促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，而血清中低水平的褪黑素不能通過結(jié)合MT1 發(fā)揮抗腫瘤作用，于是MT1 代償性異常高表達(dá)。在正常人體內(nèi)，可能由于褪黑素與MT1 的結(jié)合激活了PKA 信號(hào)通路，通過抑制MMP-2 的表達(dá)影響了Sp1 的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制腫瘤的發(fā)生。其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MT1、Sp1 的異常表達(dá)可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用;檢測(cè)兩者在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，可為探索乳腺癌相關(guān)的發(fā)病機(jī)制及基因靶向治療提供一定的依據(jù)。

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