芎麻滴丸對(duì)血管性認(rèn)知障礙過(guò)程中Cyto C、Bcl-2、Bax的影響

劉 琳，蓋祥云，趙 瑛

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

血管性認(rèn)知功能障礙是由血管因素導(dǎo)致或與之伴隨的認(rèn)知功能損害［1］。近年來(lái)，關(guān)于腦缺血后細(xì)胞凋亡的研究已成為許多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)［2-3］。雖然許多研究都已證明海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與認(rèn)知功能障礙的產(chǎn)生密切相關(guān)［4］，但多是針對(duì)凋亡產(chǎn)生機(jī)制的研究，而關(guān)于血管性認(rèn)知功能障礙產(chǎn)生的過(guò)程中海馬神經(jīng)元蛋白的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究卻鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)著重研究和動(dòng)態(tài)觀察血管性認(rèn)知功能障礙發(fā)病過(guò)程與海馬神經(jīng)元細(xì)胞蛋白Cyto C、Bcl-2、Bax之間的關(guān)系，為開發(fā)具有針對(duì)性的血管性認(rèn)知功能障礙預(yù)防用藥提供實(shí)驗(yàn)方法。為此，本實(shí)驗(yàn)選用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法建立血管性認(rèn)知功能障礙模型，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)腦組織蛋白細(xì)胞色素C(Cyto C)、Bcl-2、Bax的表達(dá)，探討血管性認(rèn)知功能障礙發(fā)病過(guò)程與細(xì)胞蛋白變化之間的關(guān)系。同時(shí)，使用改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的藥物——芎麻滴丸進(jìn)行預(yù)防用藥，研究其對(duì)蛋白Cyto C、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，探討預(yù)防血管性認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 成年健康SD雄性大鼠 (12～14周齡)120只，體質(zhì)量為300 g～350 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào):SCXK(黑)2009-10。

1.2 藥品及試劑 芎麻滴丸成型前液體:哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備 (川芎總酚酸和天麻總苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥37.77%)。濃縮制成相當(dāng)于1 g/mL生藥的溶液，保存于4℃冰箱備用。銀杏葉片 (產(chǎn)品批號(hào):0907081)購(gòu)自廣西億康藥業(yè)股份有限公司；Cyto C兔抗大鼠多克隆抗體 (產(chǎn)品批號(hào):09K01)、Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗體 (產(chǎn)品批號(hào):09L02)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Bax兔抗大鼠多克隆抗體 (產(chǎn)品批號(hào):09X01)購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 Leica RM2135石蠟切片機(jī) (德國(guó)萊卡公司)；光學(xué)顯微鏡 (日本Olympus BH-2型)。

2 方法

2.1 血管性認(rèn)知功能障礙模型的建立 采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法建立血管性認(rèn)知功能障礙大鼠模型［5］，將大鼠術(shù)前12 h禁食、4 h禁水。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，分離暴露左、右側(cè)頸總動(dòng)脈，套以0號(hào)絲線雙重結(jié)扎，逐層縫合。假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎頸總動(dòng)脈，其余同手術(shù)組。術(shù)中大鼠肛溫保持在36.5～37.5℃，術(shù)畢給予注射青霉素鈉水溶液適量局部涂敷，放入籠中飼養(yǎng)，每日肌注青霉素鈉2×105U/只，連用3 d，防治感染。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 按照動(dòng)物體質(zhì)量及跳臺(tái)成績(jī)將動(dòng)物隨機(jī)分為模型組 (生理鹽水10 mL/kg)、芎麻滴丸高劑量組 (相當(dāng)于生藥1.5 g/kg)、中劑量組 (相當(dāng)于生藥0.75 g/kg)、低劑量組 (相當(dāng)于生藥0.375 g/kg)［7］、銀杏葉片組 (61.359 mg/kg)，另加假手術(shù)組 (生理鹽水10 mL/kg)，共6組。每組動(dòng)物又分別分為4個(gè)亞組，即造模后7 d、14 d、28 d、42 d(每組5只)。于模型建立前3 d開始灌胃給藥，每天灌胃兩次，給藥持續(xù)至動(dòng)物處死當(dāng)天。

2.3 免疫組化法分別檢測(cè)大鼠海馬中Cyto C、Bcl-2及Bax的量 按兔二步法免疫組化試劑盒操作，3%H2O2孵育10 min，蒸餾水洗3次。抗原高壓熱修復(fù)2 min。冷卻至室溫，0.01 mol/L PBS洗5 min，共3次。分別滴加Cyto C兔抗大鼠多克隆抗體 (1∶50)；Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗體 (1∶50)；Bax兔抗大鼠多克隆抗體 (1∶50)，陰性對(duì)照采用PBS代替一抗，4℃過(guò)夜。PBS洗三次每次5 min。滴加生物素化二抗，20℃ ～37℃ 20 min。PBS洗3次每次5 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片，鏡檢。免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞顯色棕黃色或棕褐色，采用BI-2000免疫組化圖像分析系統(tǒng)選擇 (400×)10個(gè)不同視野進(jìn)行平均光密度值分析，取其平均值為該樣本平均光密度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17.0 For Windows統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，計(jì)量結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為有顯著性差異；P＜0.01為有非常顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腦組織海馬區(qū)Cyto C陽(yáng)性表達(dá) Cyto C免疫組化結(jié)果顯示，造模 7 d、14 d、28 d、42 d，模型組海馬區(qū)大量神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中均出現(xiàn)黃色或者棕黃色表達(dá)，芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組均可不同程度地降低陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物在造模7 d、14 d、28 d、42 d時(shí)的Cyto C陽(yáng)性表達(dá)顯著升高 (P＜0.01)，且以14 d和28 d升高更為明顯 (P＜0.01)；與模型組相比，芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組動(dòng)物在造模7 d、14 d、28 d、芎麻滴丸低、中劑量組動(dòng)物早造模42 d時(shí)的Cyto C陽(yáng)性表達(dá)顯著降低 (P＜0.01)，且以7 d時(shí)降低Cyto C表達(dá)作用更為明顯 (P＜0.01)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠腦組織海馬Cyto C陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果(，n=5)

表1 各組大鼠腦組織海馬Cyto C陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果(，n=5)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與7 d比較，▲P＜0.05；與14 d比較，△P＜0.05。

組別 劑量/(mg·kg－1)7 d 14 d 28 d 42 d假手術(shù)組 — 0.040±0.003 0.046±0.003 0.049±0.002 0.048±0.002模型組 — 0.273±0.035＊＊ 0.370±0.034＊＊▲ 0.305±0.044＊＊ 0.234±0.039＊＊△芎麻滴丸低劑量組 375 0.112±0.006## 0.196±0.037##▲ 0.222±0.021##▲ 0.182±0.003##▲芎麻滴丸中劑量組 750 0.131±0.024## 0.258±0.021##▲ 0.193±0.025##▲ 0.192±0.019##▲芎麻滴丸高劑量組 1500 0.135±0.002## 0.268±0.016##▲ 0.212±0.029##▲ 0.233±0.016▲陽(yáng)性對(duì)照組 61.359 0.118±0.010## 0.233±0.014##▲ 0.212±0.019##▲ 0.233±0.021▲

3.2 各組大鼠腦組織海馬區(qū)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá) Cyto C免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織海馬內(nèi)可見大量胞漿著色為黃色或者棕黃色的神經(jīng)元細(xì)胞，在造模7 d、14 d、28 d、42 d時(shí)，模型組大鼠腦組織海馬內(nèi)可見少量胞漿著色為淺黃色的神經(jīng)元細(xì)胞，芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組可不同程度的提高蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組相比，7 d、14 d、28 d、42 d模型組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)；與模型組相比，7 d、14 d、28 d和42 d芎麻滴丸低劑量組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)顯著升高 (P＜0.01)，7 d、28 d和42 d芎麻滴丸中劑量組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，7 d、14 d銀杏葉片組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。結(jié)果見表2。

3.3 各組大鼠腦組織海馬區(qū)Bax陽(yáng)性表達(dá) Bax免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織海馬區(qū)可見少量胞漿著色弱陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞。7 d、14 d、28 d、42 d模型組大鼠腦組織海馬區(qū)均可見大量胞漿著色強(qiáng)陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞；與模型組相比，芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組均可不同程度的降低大鼠腦組織海馬Bax陽(yáng)性表達(dá)。與模型組相比，7 d、14 d、28 d、42 d芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組 陽(yáng)性表達(dá)顯著降低 (P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果見表3。

表2 各組大鼠腦組織海馬Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果 (，n=5)

表2 各組大鼠腦組織海馬Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果 (，n=5)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組 別 劑量/(mg·kg－1)7 d 14 d 28 d 42 d假手術(shù)組 — 0.339±0.008 0.345±0.004 0.337±0.014 0.340±0.003模型組 — 0.229±0.019＊＊ 0.281±0.012＊＊ 0.244±0.016＊＊ 0.270±0.017＊＊芎麻滴丸低劑量組 375 0.284±0.025## 0.327±0.012## 0.280±0.023## 0.294±0.018##芎麻滴丸中劑量組 750 0.262±0.026## 0.282±0.034 0.268±0.028## 0.281±0.024##芎麻滴丸高劑量組 1500 0.231±0.038 0.279±0.036 0.253±0.035 0.272±0.018陽(yáng)性對(duì)照組 61.359 0.259±0.005## 0.294±0.013##0.276±0.017 0.284±0.014

表3 各組大鼠腦組織海馬Bax陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果 (，n=5)

表3 各組大鼠腦組織海馬Bax陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果 (，n=5)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別 劑量/(mg·kg－1)7 d 14 d 28 d 42 d假手術(shù)組 — 0.165±0.021 0.171±0.021 0.171±0.036 0.165±0.027模型組 — 0.217±0.022＊＊ 0.314±0.021＊＊ 0.326±0.036＊＊ 0.209±0.038＊＊芎麻滴丸低劑量組 375 0.145±0.040## 0.229±0.026## 0.235±0.032## 0.180±0.038##芎麻滴丸中劑量組 750 0.173±0.026## 0.182±0.035## 0.236±0.028## 0.191±0.053##芎麻滴丸高劑量組 1500 0.194±0.021# 0.234±0.025## 0.249±0.049## 0.190±0.023#陽(yáng)性對(duì)照組 61.359 0.200±0.019# 0.187±0.016## 0.238±0.024## 0.232±0.020#

與假手術(shù)組相比，7 d、14 d、28 d、42 d模型組陽(yáng)性表達(dá)均顯著降低 (P＜0.01)；與模型組相比，7 d芎麻滴丸低、中劑量組和銀杏葉片組Bcl-2/Bax顯著升高 (P＜0.01)；14 d、28 d芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組Bcl-2/Bax顯著升高 (P＜0.05，P＜0.01)；42 d芎麻滴丸低、中劑量組Bcl-2/Bax顯著升高 (P＜0.01)。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠腦組織海馬Bcl-2/Bax結(jié)果 (，n=5)

表4 各組大鼠腦組織海馬Bcl-2/Bax結(jié)果 (，n=5)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別 劑量 (mg·kg－1)7 d 14 d 28 d 42 d假手術(shù)組 —2.055±0.38 2.02±0.19 1.97±0.39 2.06±0.11模型組 — 1.06±0.20＊＊ 0.89±0.19＊＊ 0.75±0.21＊＊ 1.29±0.26＊＊芎麻滴丸低劑量組 375 1.96±0.46## 1.43±0.40## 1.19±0.37## 1.63±0.47##芎麻滴丸中劑量組 750 1.51±0.43## 1.55±0.45## 1.14±0.32## 1.47±0.41##芎麻滴丸高劑量組 1500 1.19±0.49 1.19±0.51# 1.02±0.41# 1.43±0.56陽(yáng)性對(duì)照組 61.359 1.30±0.26## 1.57±0.40## 1.16±0.32##1.22±0.29

4 討論

血管性認(rèn)知功能障礙是由血管因素導(dǎo)致或與之伴隨的認(rèn)知功能損害，許多研究也表明慢性腦缺血血流減少是導(dǎo)致血管性認(rèn)知功能障礙的重要因素。經(jīng)過(guò)多年研究實(shí)踐，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法建立腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ鸵驯粡V泛采用，已有研究表明模型制作6周后，大鼠出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙［6］。本研究發(fā)現(xiàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法法建立大鼠血管性認(rèn)知功能障礙模型7 d后即出現(xiàn)了Cyto C高表達(dá)，Bcl-2/Bax降低。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在模型建立后的14 d及28 d時(shí)，Cyto C高表達(dá)及Bcl-2/Bax降低達(dá)到高峰，此后有所恢復(fù)。本課題組同期研究表明:雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法法建立大鼠血管性認(rèn)知功能障礙模型后28 d，海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡也達(dá)到高峰，這一結(jié)果提示腦缺血會(huì)引起線粒體膜通透性增強(qiáng)，使得Cyto C釋放，而造成海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡。

芎麻滴丸是傳統(tǒng)中藥復(fù)方芎麻湯經(jīng)現(xiàn)代工藝提取分離并純化的中藥復(fù)方現(xiàn)代制劑，前期實(shí)驗(yàn)表明芎麻滴丸可以改善雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙［7］。而在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)所選用劑量為芎麻滴丸改善學(xué)習(xí)記憶障礙的最佳劑量，而中劑量為人體折算劑量。本研究發(fā)現(xiàn)，芎麻滴丸可以改善大鼠腦缺血后所產(chǎn)生的Cyto C高表達(dá)和Bcl-2/Bax降低，其中以芎麻滴丸低、中劑量效果最為顯著，與前期研究結(jié)果一致［7］。結(jié)果提示芎麻滴丸可能是通過(guò)線粒體途徑，抑制Cyto C，增加Bcl-2/Bax，抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮預(yù)防血管性認(rèn)知功能障礙的作用。

本研究結(jié)果同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，芎麻滴丸及銀杏葉片在抑制Cyto C高表達(dá)的過(guò)程中以7 d組效果最為顯著，這很可能是由于藥物無(wú)法拮抗腦缺血14 d時(shí)Cyto C的過(guò)度高表達(dá)而造成的，而在芎麻滴丸升高Bcl-2/Bax的過(guò)程中卻不存在這樣的現(xiàn)象。此結(jié)果提示芎麻滴丸可能還會(huì)通過(guò)其他途徑增加血管性認(rèn)知功能障礙大鼠腦內(nèi)Bcl-2/Bax，從而抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮預(yù)防作用。

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