DNS比色法測定白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑活性的方法研究

趙 蓉， 李多偉， 任 濤， 林 芳， 林道發(fā)

(1.陜西省環(huán)境科學研究院，陜西西安 710061;2.西北大學生命科學學院，陜西西安 710069)

DNS比色法測定白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑活性的方法研究

趙 蓉1， 李多偉2*， 任 濤2， 林 芳2， 林道發(fā)2

(1.陜西省環(huán)境科學研究院，陜西西安 710061;2.西北大學生命科學學院，陜西西安 710069)

目的 建立DNS比色法測定從白蕓豆中分離純化α－淀粉酶抑制劑活性的方法。方法 通過測定波長、DNS的用量及顯色反應時間的試驗，確定研究方法。結(jié)果 確定最佳條件為檢測波長470 nm，α－淀粉酶抑制劑與等量α－淀粉酶溶液37℃預溫15 min，加入2%可溶性淀粉溶液，準確反應5 min。再加入DNS試劑2 mL，沸水浴5 min后流水冷卻。該方法平均回收率為99.95%(n=9)，精密度實驗RSD=1.01%。結(jié)論 該方法具有簡便、快捷、重復性良好等特點。適用于常規(guī)α－淀粉酶抑制劑的活性測定。

白蕓豆;DNS比色法;α－淀粉酶抑制劑活性

α－淀粉酶抑制劑 (α－amylase inhibitor，簡稱 α－AI)，屬于糖苷水解酶。α－AI能抑制胃腸道內(nèi)唾液、胰淀粉酶的活性，阻礙或延緩人體對食物中主要的碳水化合物的水解和消化，降低食物中淀粉糖類物質(zhì)的分解吸收，起到降低血糖、血脂的作用，抑制血糖濃度的升高，從而有利于糖尿病患者的飲食治療。對于肥胖患者，可減少糖向脂肪轉(zhuǎn)化，延緩腸道排空，增加脂肪消耗以減輕體質(zhì)量［1］，國外已將α－淀粉酶抑制劑作為減肥保健食品進行應用［2－3］。因此，α－AI可以用來防治肥胖癥、脂肪過多癥、動脈硬化癥、高血脂及糖尿病等疾病。α－AI還可以制成生物農(nóng)藥或作為抗蟲基因，改良植物抗蟲性［4］。在酶學研究方面，α－AI可作為探究 α－淀粉酶活性部位的分析工具，作為通過選擇作用測定α－淀粉酶同工酶的反應物［5］。一些特異性抑制谷物萌發(fā)過程中合成的α－AI，也將會在烤制工業(yè)中發(fā)揮重要作用［6］。

Bowman(1945年)首次報道從白蕓豆中獲得α－AI［7］，與其他種類相比具有高效價，因其含有特殊類型的抑制劑 (耐熱和不耐熱［8］)而倍受關注。

現(xiàn)有的測定α－淀粉酶抑制劑活性的方法是將淀粉降解產(chǎn)物在特定條件下比色，測定其含有量，通過標準曲線計算酶活性。本實驗在現(xiàn)有分析方法的基礎上做出有效的改進，對DNS(3，5－二硝基水楊酸)比色法［9］測定白蕓豆中分離純化的α－淀粉酶抑制劑活性的操作條件進行系列試驗確定。

1 材料

1.1 儀器 日本島津UV－1700紫外可見光分光光度計;上海光地恒溫水浴鍋;上海實驗儀器101A－3E烘箱;上海精密科學儀器BP211D電子天平。

1.2 藥品與試劑 DNS試劑［10］:取3，5－二硝基水楊酸精確稱取6.5 g溶解于400 mL蒸餾水中，在加入325 mL 2 mol/L的氫氧化鈉、15 mL丙三醇，充分溶解后定容至1 000 mL，于棕色試劑瓶保存，冰箱中放置一周后使用。葡萄糖標準溶液 (3 mg/mL):取經(jīng)105℃烘至恒定質(zhì)量的分析純葡萄糖精確稱取300 mg，用水溶解并定容至100 mL，保存于4℃冰箱中，備用。2%可溶性淀粉溶液:精確稱取可溶性淀粉2 g，用少量蒸餾水調(diào)勻，傾入已沸蒸餾水，在加熱煮沸至透明，冷卻后定容至100 mL。其他試劑有北京奧特星α－淀粉酶 (BR)。供試品α－AI，按以下方法從白蕓豆中獲得［11］:粉碎白蕓豆，經(jīng)過水浸提、硫酸銨鹽析、透析、DEAE－纖維素柱層析、冷凍干燥，得到產(chǎn)品 (白色粉未狀)［12］。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定原理 α－AI能特異性地抑制α－淀粉酶，減少α－淀粉酶對淀粉的水解，使其淀粉降解產(chǎn)物還原糖減少，還原糖可與3，5－二硝基水楊酸共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，顯紅棕色，在一定波長下有最大吸收峰，且在此波長下還原糖含有量與吸光值呈線性關系。對添加抑制劑前后生成還原糖的量進行定量測定，可從前后變化測得α－AI的活性。

2.2 測定條件的選擇

2.2.1 吸收波長的測定 分別取0.5 mL葡萄糖標準液和蒸餾水，再加1 mL DNS試劑，沸水浴加熱5 min，流水冷卻，稀釋適當倍數(shù)。分別在波長300～500 nm和400～600 nm范圍內(nèi)，對DNS試劑本身 (蒸餾水調(diào)零)，未加α－AI的DNS顯色反應液以及DNS顯色反應液 (空白調(diào)零)的吸收光譜進行掃描，結(jié)果見圖 1。比較可知，DNS試劑(λmax=370 nm)在顯色反應測定波長處 (λmax=470 nm)無明顯吸收，可排除本底干擾，故選λmax=470 nm為檢測波長。

圖1 吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum

2.2.2 DNS試劑用量的選擇 在系列已加入1.0 mL葡萄糖標準溶液的試管中，分別加入DNS顯色劑0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，在沸水浴中加熱5 min，迅速流水冷卻，適當稀釋。在相同條件下，不加葡萄糖標準溶液作空白，在470 nm波長下測定不同DNS顯色劑用量下的吸收值。

從圖2可以看出，隨DNS顯色劑用量的增加，反應液吸收值顯著增大，但在2 mL以后，吸收值增加緩慢，且趨于平緩。故選2 mL作為DNS顯色劑的用量。

圖2 DNS顯色劑用量對吸收值的影響Fig.2 Impact of DNS reagent dosage on the absorption value

2.2.3 顯色反應時間的選擇 在系列加入葡萄糖標準液1.0 mL的試管中，分別加入DNS顯色劑2 mL，在沸水浴中分別加熱反應1、3、5、7、9、11 min后取出，迅速流水冷卻，適當稀釋。在相同條件下，以不加葡萄糖標準溶液作空白，在470 nm波長下測定不同加熱反應時間下的吸收值。從圖3可以看出，顯色反應吸收值隨時間的增加而增大，5 min后吸收值變化趨于平穩(wěn)。故選5 min作為顯色反應時間。

圖3 顯色反應時間對吸收值的影響Fig.3 Impact of reaction time on the absorption value

2.3 標準曲線的繪制 取6只試管依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標準溶液，加入2 mL DNS顯色劑后充分混勻，在沸水浴中反應5 min，迅速流水冷卻，適當稀釋。以管1做為空白對照在470 nm波長下測各管的吸收值。以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=0.817 4X+0.001 6，R2=0.999 6。表明在0.6～3 mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖濃度和相應的吸收值具有良好的線性關系。

2.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取質(zhì)量濃度1.2 mg/mL葡萄糖標準溶液，加入DNS顯色劑2 mL，于沸水浴中反應5 min，迅速流水冷卻，分別放置30、60、90、120 min后在470 nm波長下測各管的吸收值，RSD=0.37%。圖4表明該測定方法下120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 精密度測定 按1.2項中所述方法制備后，精密吸取樣品溶液500 μL，依照2.4項的DNS比色法，連續(xù)6次重復測定，結(jié)果表明該方法測定α－AI精密度良好，RSD=1.01%(n=6)。

圖4 放置時間對吸收值的影響Fig.4 Impact of standing time on the absorption value

2.6 重復性試驗 取同批次樣品，精密稱取6份按照DNS比色法進行測定，結(jié)果表明該測定方法重復性良好，RSD=0.94%(n=6)。

2.7 加樣回收率試驗 精密量取已知量的樣品溶液500 μL，共9份。分別準確加入葡萄糖標準溶液，按2.4項的DNS比色法測定，測得低、中、高3種加入量的回收率 (n=3)分別為100.3%、99.79%、99.84%;RSD分別為0.86%、0.68%、0.81%，平均回收率為99.95%(n=9)。

2.8 樣品測定

2.8.1 樣品管 精確吸取0.5 mL從白蕓豆中提取的α－AI和0.5 mLα－淀粉酶溶液，充分混勻，在37℃水浴中反應15 min，然后加入1 mL 2%可溶性淀粉溶液，在37℃水浴中準確反應5 min。再加入2 mL DNS顯色劑，在沸水浴中反應5 min，之后立即用流動自來水冷卻 (終止反應)，用蒸餾水稀釋并定容至25 mL，再精確吸取1 mL用蒸餾水稀釋定容至25 mL，在470 nm波長下測定吸收度，記為OD。

2.8.2 對照管 用蒸餾水代替α－AI，其他同上，記為 OD′。

2.8.3 空白管 用蒸餾水代替α－AI和α－淀粉酶溶液，其他同上。

α－淀粉酶抑制劑抑制率的計算公式為

按照上述測定方法，對樣品進行α－AI活性測定，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定(n=3)Tab.1 Sample determination(n=3)

3 結(jié)論

通過對顯色反應的測定波長、DNS顯色劑的用量以及顯色反應的時間等一系列試驗條件的研究，對白蕓豆中分離純化的α－淀粉酶抑制劑的DNS比色法測定，確定的最佳條件為:在470 nm波長下檢測，α－AI與等量α－淀粉酶溶液在37℃反應15 min，加入2%可溶性淀粉溶液在準確反應5 min，再加入2 mL DNS顯色劑沸水浴中顯色5 min，迅速流水冷卻。此方法精密度 RSD為1.01%，平均回收率為99.95%(n=9)。該方法具有簡便、快捷、重復性好等特點，是對已有方法的完善和改進，試圖探尋測定α－淀粉酶抑制劑活性的最佳方法和條件，適用于α－淀粉酶抑制劑活性的常規(guī)測定。該方法可作為篩選抗糖尿病藥物的有效方法。

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Activity determination of Phaseolus vulgaris α-amylase inhibitor by DNS colorimetry

ZHAO Rong1， LI Duo－wei2*， REN Tao2， LIN Fang2， LIN Dao－fa2

(1.Shaanxi Provincial Institute of Environmental Science，Xi'an 710069，China;2.Life Science College，Northwest University，Xi'an 710069，China)

Phaseolus vulgaris;DNS colorimetry;α－amylase inhibitor activity

R284. 1;Q55

A

1001－1528(2013)03－0573－04

10.3969/j.issn.1001－1528.2013.03.034

2012－04－17

趙 蓉 (1984—)，女，碩士生，主要從事環(huán)境科學研究。Tel:13572059463，E－mail:zrjbw@hotmail.com

*通信作者:李多偉 (1959—)，男，副教授，碩士生導師，主要從事天然動植物資源提取、分離與植物細胞工程研究。Tel:13227796618，E－mail:duoweili@163.com