元素指紋圖譜在藿香正氣制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

劉征輝，陳秋生，3，葉挺祥，趙洪芝，郭永澤，3，程 奕，3*

（1.天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司，天津 300381；2.天津市現(xiàn)代中藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心，天津 300381；3.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381）

藿香正氣最早記載于北宋《太平惠民和劑局方》，距今已有千年歷史，最初藿香正氣只是散劑，隨著現(xiàn)代中藥制劑技術(shù)的進(jìn)步，逐漸發(fā)展為多種劑型，藿香正氣水是其常用的一種，由蒼術(shù)、厚樸、白芷、甘草等十味中藥組成，具有解表化濕、理氣和中之功效，用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒，癥見頭痛昏重、胸膈痞悶、脘腹脹痛、嘔吐泄瀉；胃腸型感冒見上述癥候者［1］。

電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)80年代發(fā)展起來的無機(jī)元素和同位素分析測(cè)試技術(shù)，它以獨(dú)特的接口技術(shù)將電感耦合等離子體的高溫電離特性與質(zhì)譜計(jì)的靈敏快速掃描的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合而形成一種高靈敏度的分析技術(shù)。該技術(shù)具有精密度高；速度快，可在幾分鐘內(nèi)完成幾十個(gè)元素的定量測(cè)定；譜線簡單，干擾相對(duì)于光譜技術(shù)要少；線性范圍可達(dá)7～9個(gè)數(shù)量級(jí)；樣品的制備和引入相對(duì)于其他質(zhì)譜技術(shù)簡單；既可用于元素分析，還可進(jìn)行同位素組成的快速測(cè)定［2-5］。本實(shí)驗(yàn)采取微波消解進(jìn)行樣品前處理，用ICP-MS同時(shí)測(cè)定藿香正氣制劑中的5種重金屬元素和9種其它微量元素量，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)的手段對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，旨在探索不同廠家生產(chǎn)的藿香正氣制劑無機(jī)元素分布的規(guī)律［6-14］，并從無機(jī)層面為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent 7500a電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 (ICP-MS):美國Agilent公司；MARS高通量密閉微波消解系統(tǒng):美國CEM公司。玻璃器皿等用具經(jīng)10%硝酸浸泡24 h后，用超純水洗凈。國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)茶樹葉 (GBW08513):中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心；超純水由二次去離子水經(jīng)Milli-Q裝置 (電阻率≥18 MΩ)處理而得。硝酸 (優(yōu)級(jí)純，MOS級(jí)):天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

多元素混合貯備液 (美國 Agilent公司，PN 5183-4688)。內(nèi)標(biāo)溶液:1.0 mg/L Y、Sc、In、Ge、Bi混合內(nèi)標(biāo)貯備液 (美國 Agilent公司，PN 5183-4680)。調(diào)諧液:10 μg/L U、Y、Ce、T1、Co(美國Agilent公司，PN 5184-3566)。藿香正氣樣品為市售，見表1。

表1 藿香正氣制劑樣品信息Tab.1 Information of Huoxiang Zhengqi Preparation samples

1.2 方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 由多元素貯備液，用5%硝酸稀釋而成。系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0、5、10、20、50 ng/mL。

1.2.2 樣品處理 針對(duì)液體制劑與固體制劑，分別采用了不同的前處理方法。

精密稱定藿香正氣水10 g于消解管中，置電熱板上加熱使其揮發(fā)乙醇，濃縮至3 mL左右，加硝酸5 mL，加蓋，預(yù)消解過夜。再置電熱板上120℃消解3h，待消解完全并冷卻后，趕酸至1.0 mL左右，使用超純水用重量法定質(zhì)量至25 g。

精密稱定藿香正氣軟膠囊 (片、滴丸)約0.5 g于消解管中，加硝酸5 mL，加蓋，預(yù)消解過夜。再置電熱板上120℃消解6 h，待消解完全并冷卻后，110℃趕酸至1.0 mL，使用超純水用重量法定質(zhì)量至25 g。

每個(gè)樣品平行2份，以計(jì)算測(cè)定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。平行做11份空白。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)茶樹葉(GBW08513)，處理方法與樣品處理相同。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 測(cè)定條件的優(yōu)化 對(duì)RF功率、載氣流速、積分時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，提高了離子化效率、降低了干擾。優(yōu)化條件見表2。此外，通過在線加入內(nèi)標(biāo)元素，監(jiān)測(cè)信號(hào)的變動(dòng)情況，有效克服儀器信號(hào)的漂移，在選擇各個(gè)元素內(nèi)標(biāo)時(shí)，使用虛擬內(nèi)標(biāo)(VIS，Virtual Internal Standard)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)修正，可以提高定量的準(zhǔn)確性。

表2 儀器工作參數(shù)Tab.2 Instrument parameters

1.3.2 線性范圍 在0～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各元素的分析信號(hào)值與質(zhì)量濃度均呈良好線性關(guān)系，見表3。

表3 各元素檢出限與回歸方程結(jié)果Tab.3 Results of LODs and regression equations

1.3.3 方法檢出限 用11份平行空白液的測(cè)定結(jié)果，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算各元素的檢出限，見表3。

1.3.4 方法準(zhǔn)確度 用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)茶樹葉(GBW08513)對(duì)分析方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)值在允許誤差范圍內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)定 按實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定了27批次不同廠家的藿香正氣水 (軟膠囊、滴丸)各元素量，結(jié)果見表4、表5。

表4 不同藿香正氣產(chǎn)品中重金屬量Tab.4 Analysis results of heavy metal elements in different products of Huoxiang Zhengqi Preparations

2.2 藿香正氣元素指紋圖譜的化學(xué)模式識(shí)別研究 為了更加直觀的評(píng)價(jià)無機(jī)元素對(duì)藿香正氣制劑質(zhì)量的影響，根據(jù)無機(jī)元素指紋圖譜5種重金屬元素和9種其它微量元素的量進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別分析。

2.2.1 聚類分析 首先應(yīng)用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)藿香正氣水進(jìn)行聚類分析。利用歐氏距離(Euclidean)作為樣品的測(cè)度，采用離差平方和法(Ward's Method)進(jìn)行聚類，得到聚類譜系圖。由聚類結(jié)果圖可以看出不同廠家之間的差異，但相同廠家的不同批次產(chǎn)品也存在差異。

圖1、圖2分別為5種重金屬元素和9種其它微量元素的聚類結(jié)果圖。兩類不用元素的聚類結(jié)果都將27個(gè)樣本分成了兩大類，1～18號(hào)為水劑歸為到類，其它固體制劑為另一類，但根據(jù)重金屬元素的聚類結(jié)果顯示26、27號(hào)滴丸制劑也被分在水劑這一類，提示滴丸制劑可能在工藝上與其它固體制劑的不同。

表5 不同藿香正氣產(chǎn)品中其它元素的量Tab.5 Analysis results of other elements in different products of Huoxiang Zhengqi Preparations

圖1 藿香正氣5種重金屬元素量分析聚類譜系圖Fig.1 Hierarchical cluster analysis dendrogram of 5 heavy metal elements of Huoxiang Zhengqi Preparations

圖2 藿香正氣9種微量元素分析量聚類譜系圖Fig.2 Hierarchical cluster analysis dendrogram of 9 other elemtents of Huexiang Zhangqi preparations

2.2.2 主成分分析 通過對(duì)27批次的藿香正氣制劑元素指紋圖譜進(jìn)行主成分分析，得到了5種重金屬元素的主成分得分圖 (見圖3)和9種其它微量元素的主成分得分圖 (見圖4)，明顯看出，其中1～18號(hào)距離相當(dāng)緊密，明顯聚為一類，19～25號(hào)固體制劑分布在圖的上部分，26、27號(hào)滴丸樣品在液體制劑和其它固體制劑之間。這與聚類分析的結(jié)果相一致。

圖3 5種重金屬元素測(cè)定結(jié)果的主成分得分圖Fig.3 Principal component analysis(PCA)score figure of 5 heavy metal elements

圖4 9種微量元素測(cè)定結(jié)果的主成分得分圖Fig.4 Principal component analysis(PCA)score figure of 9 other elements

經(jīng)計(jì)算得到主成分的模型為:

上式中，F(xiàn)1，F(xiàn)2分別表示兩個(gè)主成分，XCu，XAs，XCd，XHg，XPb分別表示各個(gè)元素的量數(shù)據(jù)。而兩個(gè)主成分中，F(xiàn)1是特征值最大的，即是“信息最多”的指標(biāo)，而第一主成分中各個(gè)元素的系數(shù)基本相同，說明Cu、As、Cd、Hg、Pb各個(gè)元素的對(duì)分類的貢獻(xiàn)基本相同。

圖4為9種其它微量元素的主成分分析結(jié)果圖。按主成分個(gè)數(shù)提取原則為累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于85%的n個(gè)主成分，結(jié)果如下:第一主成分的特征值λ1=5.398，方差貢獻(xiàn)率為59.98%；第二主成分的特征值:λ2=1.381，方差貢獻(xiàn)率為15.343%；λ3=0.983，方差貢獻(xiàn)率為10.92%；3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.24%，選取前3個(gè)得分矢量來作圖。圖中每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)1個(gè)樣本，從圖可知，此27個(gè)樣本可分為兩類，與聚類分析結(jié)果一致，即可印證聚類結(jié)果圖。

將每一個(gè)載荷量表示主成分與對(duì)應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)除以主成分相對(duì)應(yīng)的特征值開平方根便得到兩個(gè)主成分中每個(gè)指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的系數(shù)，經(jīng)計(jì)算可得主成分的模型為:

上式中，F(xiàn)1，F(xiàn)2，F(xiàn)3分別表示兩個(gè)主成分，XNa，XMg，XK，XCa，XMn，XFe，XNi，XZn，XSe分別表示各個(gè)元素的量經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)。而兩個(gè)主成分中，F(xiàn)1是特征值最大的，即是“信息最多”的指標(biāo)，而第一主成分中系數(shù)差別不大，XK，XCa的系數(shù)大于0.4，XFe的系數(shù)小于0.1，其它元素均差別不大，說明除Fe元素貢獻(xiàn)較小外，各個(gè)元素對(duì)分類的貢獻(xiàn)差別并不大。

3 討論

3.1 應(yīng)用ICP-MS對(duì)不同產(chǎn)家不同劑型的藿香正氣產(chǎn)品進(jìn)行了5種重金屬元素和9種其它微量元素的測(cè)定，并應(yīng)用化學(xué)模式識(shí)別方法進(jìn)行聚類分析和主成分分析，不同廠家的不同藿香正氣劑型均得到了很好的聚類結(jié)果，為建立基于無機(jī)元素分析的藿香正氣質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供可能。

3.2 微量元素與活性分子在人體內(nèi)起著相互協(xié)同、互相補(bǔ)充、互相滲透、互相制約的作用，并參與體內(nèi)各種生化反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體自身調(diào)節(jié)，達(dá)到新的陰陽平衡，從而達(dá)到治療疾病的目的。本實(shí)驗(yàn)還選取了9種其它元素進(jìn)行測(cè)定，包括了人體必須的元素(Na、Mg、K、Ca)，微量元素 (Mn、Ni、Fe、Zn、Se)。從測(cè)定結(jié)果中發(fā)現(xiàn)滴丸中的 Cu、As、Cd、Hg、Pb元素的量普遍較低，與藿香正氣水中的量結(jié)果比較接近，導(dǎo)致滴丸劑型與水劑分類較為接近，但由于所收集滴丸樣本較少，此結(jié)論還待進(jìn)一步研究確證。

3.3 通過上述研究發(fā)現(xiàn)，藿香正氣水不同廠家、不同劑型之間在化學(xué)物質(zhì)層面存在著很大差異，我們?cè)陉P(guān)注有機(jī)化合物對(duì)藥品質(zhì)量影響的同時(shí)，應(yīng)注意無機(jī)元素的量對(duì)藥效的影響，在藥品的質(zhì)量控制中，探討有機(jī)物、無機(jī)物的雙層面控制保證藥品療效。因此，需要在現(xiàn)有的中藥質(zhì)量控制模式上建立起較為全面的中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)方法。

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