美洲大蠊提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張臻，宋芹，胡慧玲，何瑤，傅超美

現(xiàn)代研究表明，美洲大蠊具有組織修復(fù)、改善微循環(huán)、清除自由基、消腫、促血管增生、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤及增強(qiáng)免疫等眾多功效。尤其是蛋白質(zhì)和氨基酸含量高于50%以上，具有很好的護(hù)膚功效，因此逐漸成為國際上近年來比較流行的美容用品原材料和日化原材料。本課題所用美洲大蠊提取物是由美洲大蠊藥材粗粉以水為溶媒經(jīng)閃式提取、除雜、冷凍干燥后所得實(shí)驗(yàn)室自制粉末，課題組前期研究驗(yàn)證表明美洲大蠊提取物的制備工藝穩(wěn)定可行[1]。在工藝確定的基礎(chǔ)上，為了確保以其為原料開發(fā)的美容制劑療效可靠，課題組主要選取了與護(hù)膚功能相關(guān)的蛋白質(zhì)、氨基酸、水分為指標(biāo)控制其質(zhì)量[2~3]。

1 試驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器

UV1100紫外可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；Mili-Q超純水處理儀（美國密理博公司）；恒溫干燥箱（上海森杏實(shí)驗(yàn)有限公司，DGG-9240）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司,DZKW-4）；DL-360超聲波清洗器；高速臺(tái)式離心機(jī)（TGL-16G）；96孔酶標(biāo)板（NUNC MaxiSorp）。

1.2 材料

美洲大蠊藥材提取物（實(shí)驗(yàn)室自制）；谷氨酸對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：G-025-110305）；茚三酮（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào)：110518）；PBS（pH7.2～7.4，）(北京中金橋生物技術(shù)有限公司)、氯化亞錫、硅膠G均為分析純。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取提取物0.12 g，加水10 mL攪拌使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 取美洲大蠊對(duì)照藥材粉末1 g，加水10 mL研磨使溶解，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取10 mL水，同供試品與對(duì)照藥材溶液制備方法研磨，濾過，濾液作為陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 薄層色譜試驗(yàn) 照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部 附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(19：5：5)為展開劑，展開，取出。晾干，噴以0.5%茚三酮溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

供試品色譜中，在與對(duì)照色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照溶液在此相應(yīng)位置上無對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1 美洲大蠊藥材提取物TLC鑒別圖

2.2 水分檢查

照《中國藥典》2010年版一部附錄IX H項(xiàng)下水分測(cè)定第一法進(jìn)行測(cè)定。取美洲大蠊藥材提取物3 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋在100～105 ℃干燥5小時(shí)，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1小時(shí)，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量。

三批樣品水分檢查結(jié)果見表1。結(jié)果表明，美洲大蠊藥材提取物的平均含水量為4.67%。將美洲大蠊藥材提取物的含水量標(biāo)準(zhǔn)按150%降低，故規(guī)定水分不得過7.0%。

表1 美洲大蠊藥材提取物水分考察結(jié)果(n=3)

2.3 含量測(cè)定 [4~7]

根據(jù)參考文獻(xiàn)與預(yù)實(shí)驗(yàn)，選用紫外可見分光光度法來測(cè)定本品中總氨基酸的含量。

2.3.1 測(cè)定方法 對(duì)照品溶液的制備：取谷氨酸對(duì)照品適量，精密稱定，加PBS液（pH=7.2～7.4）配制成1 mg﹒mL-1的對(duì)照品母液[8]。

供試品溶液的制備：取美洲大蠊藥材提取物12 g，精密稱定，加純水定容至1000 mL，配成每1 mL含25 mg原生藥量的溶液。量取該溶液0.3 mL，置于25 mL容量瓶中，依次加入1.0 mL PBS液（pH=7.2～7.4）, 0.5 mL 2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15分鐘，冷卻后加純水定容，即得。

測(cè)定法：對(duì)照品和供試品溶液均在570 nm處測(cè)定吸光度。供試品可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算出谷氨酸的含量（mg），并按以下公式由測(cè)定的谷氨酸含量計(jì)算樣品總氨基酸含量：

(W-氨基酸總量，% ；C-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的谷氨酸量，mg；L1-測(cè)定用試樣量，mL；L2-試液總量，mL；M-試樣質(zhì)量，g；m-試樣干物率，%)。

2.3.2 線性關(guān)系考察 取谷氨酸對(duì)照品母液，稀釋10倍作為工作溶液，再取工作溶液2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 mL于一組25 mL容量瓶中，依次各加1.0 mL PBS液（pH=7.2～7.4），0.5 mL 2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加純水定容，放置10分鐘后，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度對(duì)應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：得到一元線性方程Y=21.467X+0.1399，r2=0.9981，在0.008～0.022 mg﹒mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取谷氨酸對(duì)照品工作溶液3.0 mL于25 mL容量瓶中，加1.0 mL PBS液（pH=7.2～7.4），0.5 mL 2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15分鐘，冷卻后加純水定容，一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果：RSD＜2%，儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取樣品溶液0.3 mL于25 mL容量瓶中，依次加入1.0 mL PBS液（pH=7.2～7.4），0.5 mL 2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15分鐘，冷卻后加純水定容，分別于0，1，2，4，8 h后測(cè)定吸光度，結(jié)果：RSD＜2%，穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取美洲大蠊藥材提取物6份，按“2.3.1”進(jìn)行供試品制備和測(cè)定，計(jì)算總氨基酸的含量。結(jié)果：RSD=2.2%，該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量M的藥材提取物5份，分別精密加入對(duì)照品適量，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備加樣回收率樣品，加樣回收率的結(jié)果見表1。平均回收率為99.3%，RSD值為2.11%。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 樣品測(cè)定 取三批美洲大蠊藥材提取物，按“2.3.1”項(xiàng)下進(jìn)行供試品制備和測(cè)定，計(jì)算總氨基酸的含量。三批樣品測(cè)定結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，谷氨酸含量均值為0.061%，氨基酸含量的均值為8.79%。綜合考慮藥材來源、制劑生產(chǎn)及貯存等因素，將美洲大蠊藥材水提物總氨基酸的含量標(biāo)準(zhǔn)略為降低，暫定本品谷氨酸含量不得少于0.049%，總氨基酸含量不得少于7.03%。

表2 美洲大蠊藥材提取物總氨基酸含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

本論文研究美洲大蠊提取物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，相比植物藥，動(dòng)物藥的化學(xué)成分更為復(fù)雜，主要成分多是蛋白質(zhì)與氨基酸。該藥材的蛋白質(zhì)與氨基酸含量高于50%以上，且兩種物質(zhì)具有組織修復(fù)、改善微循環(huán)、清除自由基等功效，符合課題組以其為原料開發(fā)美容制劑的需要。因此，課題組采用氨基酸和蛋白質(zhì)為質(zhì)控指標(biāo)，以UV控制氨基酸含量，以TLC作為蛋白質(zhì)指標(biāo)質(zhì)控的方法，同時(shí)，因?yàn)樵撍嵛镆孜保虼藢?duì)其水分進(jìn)行控制。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中暫定本品水分不得超過8.0%，總氨基酸含量不得少于7.03%。所制定的質(zhì)量控制方法簡便易行，選取的質(zhì)量控制指標(biāo)合理，能保證提取物的質(zhì)量穩(wěn)定可控。

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