胎豬BMSC體外構(gòu)建軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

劉李娜 何愛娟 周廣東 曹衛(wèi)剛

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作為良好的軟骨組織工程種子細(xì)胞來源，已被廣泛認(rèn)可[1]。與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和臍帶干細(xì)胞等相比，BMSCs具有來源廣泛、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、成軟骨分化能力高[2-4]、異體移植免疫原性低[5]及倫理接受度高等優(yōu)點(diǎn)。隨著軟骨體外構(gòu)建技術(shù)的不斷成熟，現(xiàn)在已經(jīng)能利用BMSCs在體外構(gòu)建出成熟的組織工程軟骨[6]。但是，自體組織工程軟骨構(gòu)建周期長(zhǎng)、種子細(xì)胞來源有限，難以使組織工程軟骨的構(gòu)建實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?、產(chǎn)品化。尋找合適的種子細(xì)胞是構(gòu)建異體組織工程軟骨的重要問題。根據(jù)年齡不同，BMSCs可分為成年期BMSCs、新生期BMSCs和胎齡期BMSCs。其中，成年期BMSCs已被證實(shí)可以作為軟骨再生的種子細(xì)胞[1]，但是作為異體移植軟骨種子細(xì)胞來源，胎齡期BMSCs擴(kuò)增能力更好，免疫原性更低[7]。為此，我們選取上海白豬為動(dòng)物模型，通過比較胎豬BMSCs和成年豬BMSCs的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、三向誘導(dǎo)能力及三維成軟骨能力，進(jìn)一步評(píng)估利用胎豬BMSCs作為軟骨再生種子細(xì)胞來源修復(fù)異體軟骨缺損的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

高糖DMEM、低糖DMEM、胎牛血清、胰酶、三抗（Hyclone公司，美國(guó)）；地塞米松、胰島素、牛血清白蛋白、L-谷氨酰胺、維生素C、油紅O染料（Sigma公司，美國(guó)）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸 （ITS）（R&D公司，美國(guó)）；PGA（國(guó)睿生命科技有限公司，中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胎豬BMSCs、成年豬BMSCs的分離與培養(yǎng)

胎豬BMSCs的分離與培養(yǎng)[8]：孕豬（孕期70 d）肌肉注射氯胺酮麻醉，建立靜脈通道，按常規(guī)開腹手術(shù)準(zhǔn)備，左側(cè)臥位，沿最后一肋下方10 cm處平肋弓作10 cm切口，取出子宮，切開，暴露胎豬，迅速結(jié)扎臍帶后置入75%乙醇，浸泡30 min，在超凈臺(tái)鋪無菌手術(shù)巾，取出胎豬四肢長(zhǎng)骨，用血管鉗鉗碎長(zhǎng)骨，用含10%胎牛血清的低糖DMEM沖洗，將沖洗出的骨髓液接種于10 cm2培養(yǎng)皿，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h，棄懸浮細(xì)胞，加入含5 ng/mL bFGF的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后，用0.25%的胰酶消化并傳代。

成年豬BMSCs的分離與培養(yǎng)[9-10]：成年豬肌注氯胺酮麻醉后，于髂前上棘處剃毛、消毒鋪巾，以肝素潤(rùn)濕骨穿針后穿刺，每只豬抽取10～15 mL骨髓液。骨髓液中加入20 mL低糖DMEM，1 800 r/min離心8 min，棄上層脂肪懸液，以每皿2 mL接種于10 cm2培養(yǎng)皿中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d后吸去原培養(yǎng)液，用無菌PBS緩沖液沖洗，盡量洗去培養(yǎng)液中的血細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。加入含5 ng/mL bFGF的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后，用0.25%的胰酶消化并傳代。

1.2.2 繪制細(xì)胞增殖曲線

取第3代胎豬 BMSCs、成年豬 BMSCs，胰酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，以5 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板。于接種后1～7 d，每孔加入10 μL CCK-8試劑，輕輕混勻后置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm每組OD值，每天測(cè)得數(shù)據(jù)取3孔平均值，統(tǒng)計(jì)分析，繪制增殖曲線。

1.2.3 胎豬BMSCs、成年豬BMSCs多向分化比較

1.2.3.1 成脂肪分化及檢測(cè)

取第3代胎豬BMSCs和成年豬BMSCs的細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞融合80%左右后，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，2 nM谷氨酰胺，0.5 mM 異丁基甲基黃嘌呤，1 μM 地塞米松，10 μM胰島素和200 μM吲哚美辛的高糖DMEM培養(yǎng)液），每3天換液一次，以普通培養(yǎng)液為對(duì)照組。誘導(dǎo)3周后行油紅染色。

1.2.3.2 成骨分化及檢測(cè)

取第3代胎豬BMSCs和成年豬BMSCs的細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞融合80%左右后，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，2 mM谷氨酰胺，10 mg/L 維生素 C，2.16 g/L β-磷酸甘油，40 ng/mL地塞米松的低糖DMEM培養(yǎng)液），每3天換液一次，以普通培養(yǎng)液為對(duì)照組。誘導(dǎo)3周后行茜素紅染色。

1.2.3.3 成軟骨分化及檢測(cè)

取第3代胎豬和成年豬BMSCs各0.4×106個(gè)細(xì)胞在離心管中離心形成pellet后，加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液 （含2 mM谷氨酰胺，10 ng/mL轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1，4 mM HCl，1%BSA，50 ng/mL 胰島素生長(zhǎng)因子-1，40 ng/mL 地塞米松，50 μg/mL 維生素 C，40 μg/mL Proline，1×ITS的高糖DMEM培養(yǎng)液），每3天換液一次，以普通培養(yǎng)液作為對(duì)照組。誘導(dǎo)3周后行Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4 組織工程軟骨的體外構(gòu)建

1.2.4.1 支架材料的準(zhǔn)備

取14 mg PGA加入2 mL針筒中加壓塑形，滴加1%的PLA定型，75%乙醇浸泡，無菌PBS沖洗3次，吸去PBS，加培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)12 h。

1.2.4.2 接種種子細(xì)胞及成軟骨誘導(dǎo)

取第4代胎豬和成年豬BMSCs以1×108cells/mL的濃度接種于無菌PGA/PLA支架材料上，接種后4 h用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，48 h后換軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。體外誘導(dǎo)8周后，取材。

1.2.5 組織工程軟骨的評(píng)價(jià)

1.2.5.1 大體觀察

觀察取材標(biāo)本的大小、形狀、質(zhì)地和色澤。

1.2.5.2 組織學(xué)檢測(cè)

取材，4%多聚甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，HE、Safranine-O染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色，觀察標(biāo)本的組織結(jié)構(gòu)、軟骨基質(zhì)著色及Ⅱ型膠原表達(dá)情況。

1.2.5.3 GAG含量測(cè)定

Alcian Blue法檢測(cè)構(gòu)建的軟骨組織中GAG的含量。

1.2.5.4 總膠原含量測(cè)定

利用羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)構(gòu)建軟骨組織中總膠原的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)數(shù)資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

鏡下顯示BMSCs呈梭形、三角形，胞質(zhì)圓潤(rùn)透亮，呈集落樣貼壁生長(zhǎng)。與成年豬BMSCs相比，胎豬BMSCs細(xì)胞形態(tài)比較狹長(zhǎng)，細(xì)胞核較大，生長(zhǎng)速率較快，傳代后形態(tài)無明顯改變（圖1）。

圖1 體外培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞形態(tài)（第3代，100×）Fig.1 The morphology of the tissue engineered cartilage in vitro(P3,100×)

2.2 細(xì)胞增殖曲線

細(xì)胞增殖曲線顯示，傳代培養(yǎng)的潛伏期約為24～36 h，傳代培養(yǎng)細(xì)胞的對(duì)數(shù)增殖期約為2～3 d，對(duì)數(shù)增殖期后第5天進(jìn)入平臺(tái)期。胎豬BMSCs和成年豬BMSCs倍增時(shí)間分別為30 h和60 h。細(xì)胞每傳一代，細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)2倍。從生長(zhǎng)曲線中可以看出，胎豬BMSCs的增殖速度明顯快于成年豬BMSCs（圖2）。

圖2 胎豬BMSCs和成年豬BMSCs增殖曲線Fig.2 The growth curve of fetal pig BMSCs and adult pig BMSCs

2.3 胎豬BMSCs、成年豬BMSCs三向誘導(dǎo)對(duì)比

成骨誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色，胎豬BMSCs鏡下可見大塊深染鈣結(jié)節(jié)分布，體積、數(shù)量明顯高于成年豬BMSCs。成脂誘導(dǎo)21 d后Safranine-O染色，胎豬BMSCs細(xì)胞中可見大量密集圓泡樣脂滴，含有脂滴的細(xì)胞數(shù)目和脂滴體積明顯高于成年豬BMSCs。成軟骨誘導(dǎo)21 d后行Ⅱ型膠原染色，胎豬BMSCs誘導(dǎo)成pellet和成年豬BMSCs成pellet相比，組織學(xué)無明顯差別（圖3）。

圖3 BMSCs成骨、成脂和成軟骨三向誘導(dǎo)Fig.3 The osteogenic,adipogenic and chondrogenic differentiation of BMSCs

圖4 體外構(gòu)建組織工程軟骨大體觀Fig.4 The gross observation of the tissue engineered cartilage in vitro

2.4 體外構(gòu)建組織工程軟骨大體觀

體外經(jīng)過8周的成軟骨誘導(dǎo)，新生軟骨均呈乳白色，有一定彈性及韌性，大小和支架材料接近，未見回縮。胎豬BMSCs構(gòu)建的軟骨與成年豬BMSCs相比，軟骨彈性更好，中空現(xiàn)象不明顯（圖4）。

2.5 體外構(gòu)建組織工程軟骨組織學(xué)檢測(cè)

2.5.1 HE染色

胎豬BMSCs構(gòu)建的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)比較多見，內(nèi)有細(xì)胞核，核大多位于陷窩中央，核仁明顯，周圍有藍(lán)染的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，中空現(xiàn)象不明顯。成年豬BMSCs的陷窩結(jié)構(gòu)比較幼稚，并可見較多的散在殘留的未降解的PGA纖維縱橫排列在許多陷窩之間，中空現(xiàn)象明顯（圖5）。

圖5 體外構(gòu)建軟骨（8周）組織學(xué)和免疫組化染色（40×）Fig.5 The histology and immunohistochemistry staining of the tissue engineered cartilage in vitro(8 weeks)(40×)

2.5.2 Safranin－O 染色

胎豬BMSCs和成年豬BMSCs構(gòu)建的軟骨均產(chǎn)生了富含GAG的細(xì)胞外基質(zhì)，胎豬BMSCs構(gòu)建的軟骨比成年豬BMSCs具有更強(qiáng)烈的GAG表達(dá)，在中心區(qū)域尤為明顯（圖6）。

圖6 體外構(gòu)建軟骨（8周）總膠原含量及GAG含量Fig.6 The total collagen content and GAG content of the tissue engineered cartilage in vitro(8 weeks)

2.5.3 Ⅱ型膠原免疫組化

兩組軟骨中Ⅱ型膠原的聚集、分布與aggrecan相似，成年豬BMSCs構(gòu)建的軟骨在組織的外周區(qū)域Ⅱ型膠原高度表達(dá)，而胎豬BMSCs具有更均質(zhì)和強(qiáng)烈的表達(dá)（圖5）。體外GAG檢測(cè)表示，胎豬BMSCs和成年豬BMSCs均產(chǎn)生了含Ⅱ型膠原和aggrecan的軟骨細(xì)胞樣的ECM，但是胎豬BMSCs比成年豬BMSCs具有更多的ECM分泌和更加均一的分布。

2.6 體外構(gòu)建組織工程軟骨定量測(cè)定結(jié)果比較

體外誘導(dǎo)8周，胎豬BMSCs和成年豬BMSCs構(gòu)建軟骨的平均GAG含量分別為（40.37±3.24）mg/g和 （26.58±2.67）mg/g，成年豬BMSCs構(gòu)建的軟骨GAG含量?jī)H達(dá)到胎豬BMSCs構(gòu)建的軟骨GAG含量的65.8%，兩組間存在顯著差異（P<0.01）。兩組標(biāo)本平均總膠原含量分別為 （2.07±0.16）mg/g和（1.15±0.20） mg/g， 成年豬 BMSCs構(gòu)建的軟骨總膠原含量?jī)H達(dá)到胎豬BMSCs構(gòu)建的軟骨總膠原含量的 55.6%，兩組間存在顯著差異（P<0.01）（圖 6）。

3 討論

組織工程技術(shù)的興起為軟骨缺損修復(fù)提供了新的治療途徑。BMSCs是目前軟骨構(gòu)建的最佳種子細(xì)胞之一，在關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)中已經(jīng)取得了積極的進(jìn)展[11-12]。但是，自體來源的BMSCs來源有限、體外構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，難以滿足軟骨構(gòu)建產(chǎn)品化的需求。因此，尋找合適的種子細(xì)胞是組織工程軟骨產(chǎn)品化的首要問題。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能[13]，而胚胎來源的BMSCs和成體BMSCs相比，具有體外擴(kuò)能增力強(qiáng)、免疫原性低[7]等特點(diǎn)，成為潛在的同種異體再生軟骨的種子細(xì)胞。然而，胚胎來源的BMSCs目前尚缺乏較為系統(tǒng)的研究。本研究擬通過對(duì)胎豬BMSCs和成年豬BMSCs體外構(gòu)建軟骨能力進(jìn)行系統(tǒng)比較，初步探討胚胎BMSCs構(gòu)建軟骨組織的可行性和可能存在的優(yōu)勢(shì)。

在形態(tài)上，BMSCs可貼壁生長(zhǎng)，以梭形的成纖維樣細(xì)胞為主，有研究發(fā)現(xiàn)BMSCs在體外培養(yǎng)過程中多次傳代后細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，核異染色質(zhì)減少，核仁明顯，胞漿中可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，分泌活躍，表明其可能為一種自我更新能力已經(jīng)很弱的終末分化細(xì)胞[14]。然而，我們的研究發(fā)現(xiàn)，胎豬BMSCs增殖速度快，不易老化，并且細(xì)胞貼壁形態(tài)至第3代未發(fā)生改變，保持梭形或倒三角形，細(xì)胞均勻透亮，提示胎豬BMSCs能夠體外維持自身生長(zhǎng)特性。

三向誘導(dǎo)和體外三維軟骨構(gòu)建結(jié)果提示，胎豬BMSCs比成年豬BMSCs有更好的干細(xì)胞特性，其成骨和成脂肪能力均強(qiáng)于成年豬BMSCs，是組織工程骨、軟骨和脂肪良好的種子來源。

胎豬BMSCs和成年豬BMSCs誘導(dǎo)成pellet的組織學(xué)結(jié)果，沒有明顯差別，但是兩種細(xì)胞體外三維構(gòu)建軟骨的組織學(xué)和定量結(jié)果則有明顯差別。胎豬BMSCs構(gòu)建的軟骨明顯優(yōu)于成年豬BMSCs構(gòu)建的軟骨，胎豬BMSCs作為種子細(xì)胞體外構(gòu)建的軟骨更加均質(zhì)，中空現(xiàn)象不明顯，細(xì)胞外基質(zhì)更加豐富。可能的原因有：①胎齡間充質(zhì)干細(xì)胞特性更好，成軟骨能力更強(qiáng)；②胎齡BMSCs生成軟骨的速度快于成年BMSCs，在材料未降解之前已經(jīng)生成軟骨；③胎齡BMSCs相比于成年BMSCs有更強(qiáng)的抵抗材料降解形成的酸性代謝產(chǎn)物的能力。綜合以上的原因，胎齡BMSCs在三維支架上構(gòu)建軟骨的能力優(yōu)于成年BMSCs，胎齡BMSCs能構(gòu)建出質(zhì)量更好的軟骨。

綜上所述，本研究通過對(duì)胎豬BMSCs和成年豬BMSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨進(jìn)行系統(tǒng)比較，證明胎豬BMSCs在體外培養(yǎng)體系中能構(gòu)建出質(zhì)量更好的軟骨組織，為軟骨組織工程產(chǎn)品化提供了新的前景和希望。但是胎齡BMSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建的軟骨能否成功修復(fù)同種異體軟骨缺損，尚有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

[1] Chen FH,Rousche KT,Tuan RS.Technology Insight:adult stem cells in cartilage regeneration and tissue engineering[J].Nat Clin Pract Rheumatol,2006,2(7):373-382.

[2] Bosnakovski D,Mizuno M,Kim G,et al.Chondrogenic differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)in different hydrogels:influence of collagen type II extracellular matrix on MSC chondrogenesis[J].Biotechnol Bioeng,2006,93(6):1152-1163.

[3] Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.

[4] Im GI,Jung NH,Tae SK.Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from patients in late adulthood:the optimal conditions of growth factors[J].Tissue Eng,2006,12(3):527-536.

[5] Zhao S,Wehner R,Bornhauser M,et al.Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells and their therapeutic consequences for immune-mediated disorders[J].Stem Cells Dev,2010,19(5):607-614.

[6] Mackay AM,Beck SC,Murphy JM,et al.Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow[J].Tissue Eng,1998,4(4):415-428.

[7] Zhang ZY,Teoh SH,Chong MS,et al.Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2009,27(1):126-137.

[8] Weissman IL.Stem cells:units of development,units of regeneration,and units in evolution[J].Cell,2000,100(1):157-168.

[9] Azizi SA,Stokes D,Augelli BJ,et al.Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(7):3908-3913.

[10] Coelho MJ,Fernandes MH.Human bone cell cultures in biocompatibility testing.Part II:effect of ascorbic acid,beta-glycerophosphate and dexamethasone on osteoblastic differentiation[J].Biomaterials,2000,21(11):1095-1102.

[11] Zhou G,Liu W,Cui L,et al.Repair of porcine articular osteochondral defects in non-weightbearing areas with autologous bone marrow stromal cells[J].Tissue Eng,2006,12(11):3209-3221.

[12] Im GI,Kim DY,Shin JH,et al.Repair of cartilage defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone marrow[J].J Bone Joint Surg Br,2001,83(2):289-294.

[13] Di Nicola M,Carlo-Stella C,Magni M,et al.Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J].Blood,2002,99(10):3838-3843.

[14] Mori M,Sadahira Y,Awai M.Characteristics of bone marrow fibroblastic colonies(CFU-F)formed in collagen gel[J].Exp Hematol,1987,15(11):1115-1120.