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    STIM1、ORAI1在外傷性癲癇大鼠中的表達(dá)☆

    2013-09-17 08:31:48王文肖淳李海濤唐兆華師藝峰謝延風(fēng)石全紅
    中國神經(jīng)精神疾病雜志 2013年4期
    關(guān)鍵詞:鈣通道皮層癲癇

    王文肖淳李海濤唐兆華師藝峰謝延風(fēng)石全紅

    外傷性癲癇(post-traumatic epilepsy,PTE)是繼發(fā)于顱腦損傷后的發(fā)作性功能異常,在開放性顱腦損傷中發(fā)生率可達(dá)50%甚至更高比例[1]。PTE嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,其發(fā)病機制和防治一直是神經(jīng)外科醫(yī)師研究的難點和熱點。已有大量研究表明鈣通道參與癲癇形成[2-4],鈣通道異常引起Ca2+過度內(nèi)流,大量神經(jīng)元同步過度放電,導(dǎo)致癲癇發(fā)作。鈣釋放激活的鈣(calcium release-activated calcium,CRAC)通道是鈣通道中的一種位于細(xì)胞質(zhì)膜上的慢鈣通道?;|(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)和鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1(calcium release-activated calcium channel modulator 1,ORAI1/CRACM1)是CRAC通道的兩個關(guān)鍵蛋白,介導(dǎo)CRAC通道的組成和激活。本實驗通過建立PTE大鼠模型,研究STIM1和ORAI1在PTE大鼠腦組織中的表達(dá)變化,以期闡明CRAC通道與PTE的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象 清潔級健康雄性SD大鼠84只,體質(zhì)量200~250g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。用抽簽法隨機分為對照組42只和實驗組42只。試劑:100 mmol/L FeCl3溶液(美國Sigma公司),STIM1兔單克隆抗體IgG(美國Abcam公司),ORAI1兔多克隆抗體IgG(美國Proteintech Group公司),β-肌動蛋白(actin)鼠多克隆抗體IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(中國北京中杉金橋公司),PCR引物由北京六合華大基因科技公司合成,Trizol RNA抽提試劑、SYBR Green PCR Master Mix及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。

    1.2 PTE模型的制作 大鼠經(jīng)3.5%水合氯醛溶液(10mL/kg)腹腔麻醉后固定于立體定位儀上,手術(shù)暴露顱骨。參照Golden N等[5]實驗方法,在左側(cè)冠狀縫后1mm、矢狀縫旁2mm處鉆開顱骨。用微量注射器將5μL濃度為100mmoL/L FeCl3溶液在5min內(nèi)勻速注射到大鼠皮層內(nèi),進(jìn)針深度3mm,注射完后,留滯針頭5min以防外溢。對照組注射等量生理鹽水。2h后(麻醉完全蘇醒)觀察行為學(xué)表現(xiàn),參照改良Racine法(無任何癲癇發(fā)作行為記0分;凝視發(fā)作記1分;規(guī)律性點頭或濕狗樣抖動,伴或不伴面部抽動記2分;單側(cè)前肢抖動記3分;站立、雙前肢抖動及持續(xù)性點頭記4分;雙側(cè)肢體顫動加重,失去平衡跌倒而全身性強直陣攣性發(fā)作記5分;發(fā)作衰竭導(dǎo)致死亡記6分)對大鼠癲癇發(fā)作進(jìn)行評分,癲癇發(fā)作判定:將≥3分的行為學(xué)改變定義為癲癇發(fā)作,視為制模成功,對造模不成功或死亡的動物剔出實驗,并通過隨機抽樣原則補齊動物并重新造模。按不同時間點(傷后6h、24h、72h、7d、14d、21d、28d)隨機選取6只大鼠,腹腔麻醉后斷頭取腦組織。

    1.3 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測STIM1和ORAI1 mRNA表達(dá) STIM1上游引物5'-CTGGTGGAGAAACTGCCTGAC-3',下 游 引 物 5'-GGCTAAGAGAATGGGAAGAATCC-3';ORAI1 上游 引 物5'- AGGGTTGCTCATCGTCTTTAGTG -3',下 游 引物 5'- CTCGTGGGGTGACTCTTTGAC -3';β-actin上 游 引物 5'- ACGGTCAGGTCATCACTATCG -3',下游引物5'- GGCATAGAGGTCTTTACGGATG -3'。Trizol法提取細(xì)胞總RNA,微量分光光度計檢測RNA樣品濃度(A值)及純度(A260/A280值在1.7~2.0范圍內(nèi))并進(jìn)行標(biāo)化。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件如下:37℃15min,85℃ 5s,保存于-20℃。以cDNA為模板,β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下:50℃ 2min,95℃ 5min;95℃ 20s,55℃ 20s,72℃30s,40個循環(huán)。反應(yīng)體系為25μL。PCR結(jié)果采用Ct值比較相對定量法,β-actin為內(nèi)參照。

    1.4 Western blot檢測STIM1和ORAI1蛋白表達(dá)按說明書提取總蛋白質(zhì),并用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度并標(biāo)化。以β-actin為內(nèi)參蛋白。蛋白樣品加入變性緩沖液于沸水中煮5min,10000 r/min離心5min后上樣。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。于5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜;分別加入抗STIM1抗體(1∶2000)、抗ORAI1抗體(1:800)、抗β-actin抗體(1∶3000)置于4℃孵育過夜;加入二抗(1∶3750)于37℃孵育1 h?;瘜W(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。

    1.5 免疫組化檢測STIM1和ORAI1蛋白表達(dá)取出石蠟塊,行連續(xù)冠狀切片,片厚5μm,按照說明書采用SP法進(jìn)行染色。以PBS代替一抗作陰性對照。STIM1一抗?jié)舛葹?:100,ORAI1一抗?jié)舛葹?:800。采用Image-Pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進(jìn)行掃描,半定量分析STIM1和ORAI1在實驗組和對照組皮層中的表達(dá)。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0分析,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(用LSD-t檢驗比較兩兩之間的差異),兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。檢測水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 行為學(xué)觀察 對照組未觀察到癲癇發(fā)作。實驗組共給50只大鼠注射FeCl3,其中42只出現(xiàn)典型癲癇發(fā)作,制模成功率為84.0%。傷后6h內(nèi)出現(xiàn)程度不一的癲癇發(fā)作,如凝視、不動,重復(fù)、刻板地點頭、咀嚼,濕狗樣抖動,伴或不伴面部抽動,單側(cè)前肢震顫及持續(xù)性點頭,雙前肢顫動加重失去平衡跌倒,全身性強直-陣攣發(fā)作,未見發(fā)作嚴(yán)重而死亡的大鼠。平均約30 min發(fā)作1次,每次持續(xù)1~3 min,局灶性發(fā)作多見,發(fā)作間期進(jìn)食、活動減少。3d內(nèi)癲癇發(fā)作仍較頻繁,平均每小時發(fā)作1次,持續(xù)時間約1~2min。7d后發(fā)作次數(shù)有所減少,但每日均有2~4次的規(guī)律發(fā)作。28d癲癇發(fā)作顯著減少,其中4只可見1次發(fā)作,另2只未見發(fā)作。

    2.2 RT-PCR結(jié)果 實驗組傷后STIM1、ORAI1各個時間點的表達(dá)與對照組比較均顯著增高(F值分別為 120.829、45.882,P均<0.05),72h 組表達(dá)為最高峰(P均<0.05)。見表1。

    2.3 Western blot結(jié)果 對照組與實驗組各時間點STIM1、ORAI1比較有統(tǒng)計學(xué)意義(F分別為27.615、65.093,P均<0.05)。兩兩比較,實驗組傷后6h STIM1的表達(dá)與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.322),此后6個時間點的表達(dá)與對照組比較均顯著增高(傷后24h、72h、7d、14d、21d、28d的P均<0.01),72h組表達(dá)為最高峰(P均<0.01)。實驗組傷后6h ORAI1表達(dá)與對照組比較無明顯變化(P值為0.054),此后6個時間點的表達(dá)與對照組比較均顯著增高(傷后24h、72h、7d、14d、21d、28d的P均<0.01),72h組表達(dá)為最高峰(P均<0.01)。見表1、圖1~3。

    2.4 免疫組化結(jié)果 在STIM1和ORAI1傷后表達(dá)高峰時間點(72h),取傷灶周邊皮層做免疫組織化學(xué)法,進(jìn)一步測定其蛋白的表達(dá)水平。STIM1在對照組皮層神經(jīng)元中僅有弱陽性表達(dá),實驗組STIM1在細(xì)胞膜表面的表達(dá)量與對照組比較明顯增加(t=16.233,P<0.05)。ORAI1在對照組皮層神經(jīng)元僅有弱陽性表達(dá),實驗組ORAI1在細(xì)胞膜表面的表達(dá)量與對照組比較明顯增加(t=17.339,P<0.05)。見圖4、表2。

    表1 大鼠皮層STIM1、ORAI1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

    表2 PTE大鼠皮層STIM1、ORAI1陽性表達(dá)(AOD值)水平

    3 討論

    目前研究認(rèn)為顱腦外傷后出血分解產(chǎn)生的鐵離子對神經(jīng)細(xì)胞的損傷是PTE的啟動因素[6],因此常用皮層注射鐵離子致動物癲癇發(fā)作,制作PTE模型,研究PTE發(fā)作的機制[7,8]。本實驗組共給50只大鼠注射FeCl3,制模42只,成功率達(dá)84.0%,傷后28d,均有癲癇發(fā)作,成功制作FeCl3外傷性癲癇模型。說明FeCl3誘導(dǎo)的大鼠癇性發(fā)作成功率高、穩(wěn)定性好,是一種理想的PTE動物模型。

    CRAC通道是位于細(xì)胞質(zhì)膜上的慢鈣通道,對鈣離子具有高度選擇性,鈣庫中鈣濃度明顯下降或清空時被激活。STIM1和ORAI1與CRAC通道的組成和激活密切相關(guān)。STIM1主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),其主要作用是感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫中鈣濃度的多少,并將這一信號傳遞至細(xì)胞膜上的CRAC通道,直接調(diào)控通道的開啟和關(guān)閉[9]。ORAI1位于細(xì)胞膜上,目前認(rèn)為是構(gòu)成CRAC通道的主要成分。大量研究顯示在自身免疫病、免疫缺陷病、支氣管哮喘等諸多人類疾病中,CRAC通道活性異常。近年研究認(rèn)為動物神經(jīng)元也存在CRAC通道[10,11],特別是椎體神經(jīng)元的胞體和樹突、小腦的浦肯野和顆粒神經(jīng)元。

    圖1 大鼠皮層STIM1、ORAI1蛋白的表達(dá),*:與對照組比較,P<0.05

    圖2 Western blot顯示大鼠皮層STIM1蛋白的表達(dá),1:對照組;2:實驗組6h;3:實驗組24h;4:實驗組72h;5:實驗組7d;6:實驗組14d;7:實驗組21d;8:實驗組28d

    圖3 Western blot顯示大鼠皮層ORAI1蛋白的表達(dá),1:對照組;2:實驗組6h;3:實驗組24h;4:實驗組72h;5:實驗組7d;6:實驗組14d;7:實驗組21d;8:實驗組28d

    圖4 免疫組化檢測傷后72h大鼠皮層STIM1、ORAI1的表達(dá)情況。A:STIM1對照組(400×),B:STIM1實驗組(400×)C:ORAI1對照組(400×),D:ORAI1實驗組(400×)

    本組研究通過對大鼠行為學(xué)的觀察,發(fā)現(xiàn)鐵離子致傷后大鼠癲癇發(fā)作明顯增加。同時,RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),PTE大鼠傷后不同時間點STIM1、ORAI1的mRNA表達(dá)均顯著升高,Western blot檢測顯示STIM1、ORAI1蛋白在傷后也明顯增加,免疫組化同樣證實了STIM1、ORAI1蛋白在傷后的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果充分說明CRAC通道異常與外傷性癲癇密切相關(guān)。目前研究認(rèn)為,細(xì)胞受刺激后可激活細(xì)胞膜磷脂酶C(phospholipase C,PLC),作用于4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)使其分解為三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate,IP3)和甘油二脂。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合,引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度輕微升高,由此進(jìn)一步引起更多IP3受體通道的開放,大量Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度的降低激活STIM1;與此同時,質(zhì)膜上的ORAI1蛋白自發(fā)的組裝成四聚體CRAC通道[12]。我們推測,鐵離子致傷后導(dǎo)致神經(jīng)元過氧化反應(yīng),可能通過上述途徑大量激活STIM1和ORAI1,從而使CRAC通道開放增多,導(dǎo)致Ca2+大量內(nèi)流。Ca2+大量內(nèi)流引起神經(jīng)元持續(xù)去極化,形成同步性爆發(fā)性放電,導(dǎo)致癲癇發(fā)生[13]。

    本組研究還發(fā)現(xiàn)在傷后28d,實驗組仍有癲癇發(fā)作,且STIM1、ORAI1的表達(dá)仍顯著高于對照組。Steinbeck JA等也發(fā)現(xiàn)在鼠類慢性癲癇模型以及人類顳葉癲癇腦標(biāo)本中,STIMI的表達(dá)明顯增高[14]。提示CRAC通道異常還可能參與晚期癲癇的形成。這可能與胞內(nèi)鈣超載致神經(jīng)元凋亡,膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生,膠質(zhì)瘢痕形成,引起神經(jīng)元膜電位平衡性和穩(wěn)定性紊亂有關(guān)[15]。此外,Gasperini R等研究發(fā)現(xiàn)CRAC通道與突觸可塑性有關(guān)[16],PTE大鼠皮層STIM1和ORAI1表達(dá)上調(diào),也可能通過突觸重建導(dǎo)致晚期癲癇發(fā)生。

    綜上所述,本實驗結(jié)果提示STIM1和ORAI1的表達(dá)上調(diào)與大鼠PTE發(fā)作密切相關(guān)。通過對國內(nèi)外對CRAC通道功能及PTE相關(guān)機制研究的分析,結(jié)合本研究結(jié)果,鐵離子致傷后可能通過STIM1和ORAI1的表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致CRAC通道大量開放,過度鈣內(nèi)流引起神經(jīng)元異常放電、膠質(zhì)瘢痕形成、突觸重建,最終誘發(fā)外傷性癲癇。需要指出的是,本研究目前只能反映CRAC通道與PTE的相關(guān)性,這是本文的不足之處。在后期實驗中,我們將通過阻斷CRAC通道,觀察PTE大鼠行為學(xué)的變化,并同步檢測神經(jīng)元膜電位、CRAC通道電位及鈣離子濃度的變化等研究,來進(jìn)一步探討CRAC通道異常導(dǎo)致PTE發(fā)生的具體機制。

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