精神分裂癥患者探究性眼球軌跡運(yùn)動(dòng)與表皮生長(zhǎng)因子4（ERBB4）基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)

李梓萌潘超盧天蘭阮燕燕朱日升王力芳閻浩岳偉華張岱

精神分裂癥是一種臨床表現(xiàn)復(fù)雜、病因尚不明確的重性精神疾病。到目前為止，已報(bào)道精神分裂癥的易感基因達(dá)1000多個(gè)[1]，但不同研究得到陽(yáng)性驗(yàn)證的易感基因?yàn)閿?shù)不多。因此，研究人員更為關(guān)注精神分裂癥的生物學(xué)標(biāo)記。已有研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者眼球軌跡運(yùn)動(dòng)異常可能是該病的生物學(xué)標(biāo)記之一[2]，本課題組成員前期研究也已發(fā)現(xiàn)，探究性眼球軌跡運(yùn)動(dòng)（exploratory eye movement，EEM）異?？赡苁蔷穹至寻Y的生物學(xué)標(biāo)記之一[3]。但通過探索EEM相關(guān)易感基因以闡釋精神分裂癥發(fā)病機(jī)制的報(bào)道仍屬罕見。課題組前期發(fā)現(xiàn)中國(guó)漢族人群中表皮生長(zhǎng)因子4（V－erb－b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4,ERBB4）基因多態(tài)性與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)[4]，但對(duì)于ERBB4基因多態(tài)性與EEM的關(guān)聯(lián)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此本研究對(duì)139例中國(guó)漢族人群精神分裂癥患者進(jìn)行了ERBB4基因多態(tài)性與EEM的關(guān)聯(lián)研究。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象來自北京大學(xué)第六醫(yī)院2003年11月至2004年12月住院的精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國(guó)精神障礙診斷統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders－IV，DSM－IV）精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，由兩名以上精神科醫(yī)師（其中至少一名為主治醫(yī)師）獨(dú)立診斷，且診斷一致；②漢族；③患者本人及其法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：符合DSM－IV診斷標(biāo)準(zhǔn)的其他軸I精神障礙診斷，患有嚴(yán)重軀體疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、有頭部外傷史。本研究共入組139例精神分裂癥患者，其中男性69例，女性70例；年齡16～49歲，平均（29.2±8.7）歲；受教育年限9～21年，平均（13.1±2.8）年；病程 1～360個(gè)月，中位數(shù)48個(gè)月；陽(yáng)性和陰性癥狀評(píng)定量表（positive and negative symptom scale，PANSS）總分（76.96±17.85）分，其中陽(yáng)性癥狀（22.61±7.09）分，陰性癥狀（19.37±6.98）分，一般精神病理癥狀（35.25±9.05）分；服用抗精神病藥物的劑量（氯丙嗪當(dāng)量）為（506.22±284.04）mg/d。本研究已獲得北京大學(xué)第六醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 探究性眼球軌跡運(yùn)動(dòng)檢查 應(yīng)用眼球軌跡運(yùn)動(dòng)標(biāo)記記錄儀（型號(hào)：NAC－8，日本提供）對(duì)139例患者進(jìn)行探究性眼球軌跡運(yùn)動(dòng)檢查，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)原理及指標(biāo)評(píng)定方法參見文獻(xiàn)[5－6]。

實(shí)驗(yàn)步驟：受試者頭部戴檢查裝置，裝置兩側(cè)各裝有微型紅外線光源，此光源以“＋”為標(biāo)記反映眼球活動(dòng)，并顯示在監(jiān)視器上。裝置前上方的自動(dòng)照相機(jī)鏡頭記錄患者正前方屏幕上的投影圖像，并將實(shí)驗(yàn)資料記錄于錄像帶上。檢查時(shí)受試者前方1.5m的屏幕上會(huì)依次呈現(xiàn)三個(gè)水平放置的“S”圖形（S1、S2、S3），記錄儀記錄受試者觀看該圖形時(shí)的眼球軌跡運(yùn)動(dòng)。首先，放映圖S115s，要求受試者即刻畫出該圖形；其次，分別放映與圖S1稍有不同的圖S2和圖S3各15s，要求受試者分別予以比較并回答異同之處；第三，再次放映圖S115s，要求受試者再次畫出該圖形。檢查在患者住院一周內(nèi)完成，以保證檢查結(jié)果的客觀一致性。

評(píng)定方法：本研究選用反應(yīng)性探究分（responsive search score,RSS）和認(rèn)知性探究分（cognitive search score,CSS）作為兩項(xiàng)主要評(píng)定指標(biāo)。RSS評(píng)定方法：將圖S2和圖S3各分成7個(gè)區(qū)域，要求受試者分別注視兩幅圖各5s，再與圖S1作回憶性比較；當(dāng)檢查者最后追問“還有什么不同嗎？”，受試者講出“沒有了”時(shí)，立即計(jì)算受試者在此5s內(nèi)注視圖S2和圖S3各個(gè)區(qū)域的點(diǎn)數(shù)，每點(diǎn)記一分，兩幅圖總分最多14分。CSS評(píng)定方法：要求受試者分別注視圖S2和圖S3各15s，再與圖S1作回憶性比較；將圖S2和圖S3共分成9個(gè)部分，凡是對(duì)圖的兩端和兩個(gè)附著物中的任何部分注視點(diǎn)在3個(gè)或3個(gè)以上即可記1分，兩幅圖總分最多9分。

1.2.2 ERBB4基因型檢測(cè) 抽取所有患者外周靜脈血5mL，置于EDTA抗凝管中，分裝血漿和血細(xì)胞后保存于－80℃冰箱，采用Qiagen公司生產(chǎn)小量血液基因組DNA抽提試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）提取全基因組DNA，－80℃保存待用。

本研究前期采用Illumina HumanHap610單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）芯片，分別對(duì)746例患者和1 599例對(duì)照的620 901個(gè)SNP進(jìn)行基因分型及精神分裂癥全基因組關(guān)聯(lián)研究[7]。本研究?jī)H對(duì)其中139例接受過EEM檢測(cè)的精神分裂癥患者ERBB4基因的447個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型信息進(jìn)行EEM與ERBB4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析。ERBB4基因的447個(gè)SNPs位點(diǎn)中，345個(gè)SNPs位于ERBB4基因的內(nèi)含子區(qū)，102個(gè)SNPs位于ERBB4基因的3’UTR區(qū)，各SNPs位點(diǎn)相關(guān)遺傳信息詳細(xì)注釋參見Illumina網(wǎng)站Human-Hap610 SNP芯片（www.illumina.com）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用PLINK v1.07軟件對(duì)ERBB4基因447個(gè)SNPs位點(diǎn)及EEM參數(shù)進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)分析（quantitative trait locus,QTL），方法為多元線性回歸分析（檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為Wald檢驗(yàn)的R2值）。多重檢驗(yàn)校正采用陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤率（Positive false discovery rate，pFDR）法，校正后檢驗(yàn)水準(zhǔn)要求q＜0.2[8]。采用SPSS v16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。采用 QUANTO 1.2.4軟件（http://hydra.usc.edu/gxe），估算目前樣本量（n＝139例）的統(tǒng)計(jì)效能。

2 結(jié)果

2.1 精神分裂癥患者的EEM結(jié)果 反應(yīng)性探究分（RSS）范圍為5～11分，平均（8.22±1.56）分；認(rèn)知性探究分（CSS）范圍為2～7分，平均（5.06±0.97）分。

2.2 精神分裂癥患者EEM與ERBB4基因位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)結(jié)果 采用QUANTO 1.2.4軟件計(jì)算目前樣本量（n＝139例）的統(tǒng)計(jì)效能，設(shè)患病率為1%、少見等位基因頻率（MAF）為0.2、變異系數(shù)R2為0.05、I類錯(cuò)誤率α為0.05，估算統(tǒng)計(jì)效能約為76%。對(duì)EEM與ERBB4基因447個(gè)SNPs進(jìn)行QTL關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與精神分裂癥患者EEM的RSS和CSS同時(shí)關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)共有7個(gè)，分別為rs12619728，rs17737553，rs1344906，rs10168717，rs10165449，rs10932380，rs7594456，詳見表1。不同基因型攜帶者之間的RSS和CSS指標(biāo)差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且經(jīng)多重檢驗(yàn)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤率（pFDR）校正，仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q＜0.2）。詳見表2。

表1 與精神分裂癥患者EEM的RSS及CSS同時(shí)關(guān)聯(lián)的ERBB4基因的7個(gè)SNPs位點(diǎn)信息

3 討論

眼球運(yùn)動(dòng)檢查對(duì)精神障礙的研究已有百余年的歷史，Diefendorf和Dodge等在1908年首次提出精神分裂癥患者在注視一個(gè)特定的移動(dòng)目標(biāo)時(shí)存在障礙[9]。Holzman等于1973年首次報(bào)道精神分裂癥患者存在眼球軌跡運(yùn)動(dòng)功能的障礙[6]。近十年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)此做了大量的研究，均顯示大多數(shù)精神分裂癥患者存在眼球軌跡運(yùn)動(dòng)異常[2,10]。目前國(guó)際應(yīng)用的眼球軌跡運(yùn)動(dòng)檢查主要有三種類型：一類是平穩(wěn)視蹤眼球運(yùn)動(dòng)（smooth pursuit eye movement,SPEM）；第二類是掃視眼球運(yùn)動(dòng)（saccade eye movement,SEM）；第三類是探究性眼球軌跡運(yùn)動(dòng)（exploratory eye tracking movement,EEM）。有研究提示，EEM可能是精神分裂癥的生物學(xué)標(biāo)記之一[5,10]，但其機(jī)制不詳。

到目前為止，國(guó)外有若干關(guān)于精神分裂癥患者眼球軌跡運(yùn)動(dòng)與基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者SPEM和SEM關(guān)聯(lián)[11－12]，但至今尚無文獻(xiàn)報(bào)道ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者EEM的關(guān)聯(lián)，因此本研究對(duì)精神分裂癥患者EEM與ERBB4基因多態(tài)性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究。有文獻(xiàn)報(bào)道，RSS的改變對(duì)精神分裂癥有特征性意義，被認(rèn)為對(duì)遺傳學(xué)研究有重要價(jià)值[6,13－14]。并且RSS和CSS可以反映患者認(rèn)識(shí)、記憶以及信息加工等方面的認(rèn)知功能。本研究選取EEM的RSS和CSS指標(biāo)可能也反映了精神分裂癥患者認(rèn)知功能障礙的某種機(jī)制。有文獻(xiàn)報(bào)道，抗精神病藥物、病程長(zhǎng)短以及臨床癥狀對(duì)EEM影響不大[3,15]，因此可排除上述因素對(duì)本研究結(jié)果的影響。

表2 精神分裂癥患者EEM的RSS、CSS指標(biāo)與ERBB4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者SPEM和SEM關(guān)聯(lián)[11－12]，提示ERBB4基因多態(tài)性可能與眼球軌跡運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)。ERBB4基因位于染色體2q34，含有28個(gè)外顯子，編碼一種跨膜酪氨酸激酶，作為神經(jīng)調(diào)節(jié)素1（neuregulin 1,NRG1）的受體，在精神分裂癥的神經(jīng)發(fā)育過程（尤其是突觸成熟及神經(jīng)元遷移）中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[16－17]。課題組前期已發(fā)現(xiàn)中國(guó)漢族人群中ERBB4基因的兩個(gè)內(nèi)含子多態(tài)性位點(diǎn)與精神分裂癥有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（rs6435689：P＝0.009；rs11887531：P＝0.008）[4]，提示 ERBB4 可能參與調(diào)節(jié)精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制。本研究基于前期精神分裂癥的全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果[7]，提取了精神分裂癥患者ERBB4基因的447個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型信息進(jìn)行EEM與ERBB4基因各SNPs的QTL關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)ERBB4基因上的7個(gè)SNPs位點(diǎn)與精神分裂癥患者EEM的RSS和CSS指標(biāo)同時(shí)關(guān)聯(lián)，分別為 rs12619728、rs17737553、rs1344906、rs10168717、rs10165449、rs10932380和 rs7594456（p＜0.05），且經(jīng)多重檢驗(yàn)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤率（pFDR）校正，仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q＜0.2）。盡管這一發(fā)現(xiàn)與課題組前期所發(fā)現(xiàn)的精神分裂癥的疾病關(guān)聯(lián)位點(diǎn)（rs6435689、rs11887531）不同[4]，但課題組前期發(fā)現(xiàn)ERBB4基因的兩個(gè)內(nèi)含子SNPs位點(diǎn)（rs6435689、rs11887531，位于本研究發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的下游）與精神分裂癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)，在一定程度上反映了該基因及其所在染色體區(qū)域可能存在精神分裂癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及眼動(dòng)異常關(guān)聯(lián)的遺傳基礎(chǔ)，進(jìn)一步驗(yàn)證了ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者EEM關(guān)聯(lián)的假說，但其機(jī)制需要進(jìn)一步探索。然而，本研究沒有能夠重復(fù)Bae等[11]報(bào)道的韓國(guó)人群中精神分裂癥患者眼球軌跡運(yùn)動(dòng)與ERBB4的SNP（rs7598440）關(guān)聯(lián)的結(jié)論，原因可能與不同種族遺傳背景差異以及眼球軌跡運(yùn)動(dòng)檢查類型不同有關(guān)。

總之，本研究對(duì)漢族精神分裂癥患者進(jìn)行的ERBB4基因多態(tài)性與EEM的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果提示ERBB4基因多態(tài)性與精神分裂癥患者EEM顯著關(guān)聯(lián)，驗(yàn)證了EEM可能是精神分裂癥的生物學(xué)標(biāo)記之一，并與精神分裂癥的易感基因關(guān)聯(lián)。上述發(fā)現(xiàn)仍需在其他人群中進(jìn)一步驗(yàn)證ERBB4基因多態(tài)性與EEM的關(guān)聯(lián)。本研究設(shè)計(jì)僅對(duì)精神分裂癥患者EEM與ERBB4基因多態(tài)性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究，未設(shè)置正常對(duì)照，因此未能得出EEM異?？赡苁蔷穹至寻Y患者特定的生物學(xué)標(biāo)記的結(jié)論[6]，將來擬增加正常對(duì)照組以驗(yàn)證該結(jié)論。

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