酶解刺參內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽的研究

閆鳴艷，秦 松

(中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003)

人體內(nèi)存在過剩的活性氧自由基，這些活性氧自由基若不加以清除，可破壞人體內(nèi)的DNA、生物膜、蛋白質(zhì)等，導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生，加快人體衰老?？寡趸瘎┦巧矬w實現(xiàn)自我保護的最根本性機制［1］。目前使用較多的是化學(xué)合成抗氧化劑，雖然具有較好的清除自由基活性，但是存在致癌等毒副作用，各國政府紛紛出臺強制措施限制其過量添加。在這種情況下，天然抗氧化劑以天然、安全、健康、營養(yǎng)等特點，受到消費者的青睞?？寡趸氖翘烊豢寡趸瘎┑囊环N，指那些具有抗氧化生理活性的多肽類，近年來已成為食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。刺參是山東省膠州灣地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要海參品種。近年來其養(yǎng)殖和加工規(guī)模不斷擴大，然而其綜合利用程度較低，加工過程中產(chǎn)生的內(nèi)臟(腸、卵)等副產(chǎn)物未得到充分開發(fā)利用。研究發(fā)現(xiàn)刺參內(nèi)臟與體壁含有同樣豐富的蛋白質(zhì)和活性成分［2］，可用于制備生物活性肽。目前已有利用海參腸［3］和卵［4］制備多肽的研究報道，但是這些研究均以水解度為主要指標研究內(nèi)臟蛋白的酶解工藝，未發(fā)現(xiàn)以自由基的清除率為指標研究酶解內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽的報道。本實驗以刺參內(nèi)臟為原料，初步研究了內(nèi)源蛋白酶的性質(zhì)，在此基礎(chǔ)上研究了其酶解條件，并與八種外源蛋白酶比較篩選出制備抗氧化肽所用的蛋白酶，對酶解條件進行了優(yōu)化，確定由刺參內(nèi)臟制備抗氧化肽的最佳酶解工藝，為刺參內(nèi)臟的加工利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺參內(nèi)臟 山東東方海洋科技股份有限公司提供，－20℃保存實驗時4℃解凍。

食品級堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司;食品級胰蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶湖北康寶泰精細化工有限公司;其他試劑均為分析純。

磁力攪拌器(82－2A) 金壇市科析儀器有限公司;高速臺式冷凍離心機(TGL－16M) 長沙湘儀離心機儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋(DK－S24)上海精宏實驗設(shè)備有限公司;精密增力電動攪拌器(JJ－1) 江蘇金壇市雙捷實驗儀器廠;電子天平(AL204－IC)梅特勒－托利多儀器有限公司;紫外可見分光光度計(721E)上海光譜儀器有限公司;pH計(PHS－3C)上海虹益儀器儀表有限公司;氣浴恒溫振蕩器(ZD－85A)金壇市恒豐儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶的制備 將刺參內(nèi)臟中泥沙除凈，剪成小塊備用。內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶的提取方法參照Fu的方法［5］。稱取內(nèi)臟60g，加入180mL低溫預(yù)冷的50mmol/L的 Tris－HCl緩沖液(pH7.5)，于4℃條件下攪拌提取 5h，12000r/min低溫離心20min，上清液即為內(nèi)源蛋白酶粗酶液。蛋白酶活力測定參照SB/T 10317－1999，采用福林－酚法，以酪蛋白為底物。

1.2.2 內(nèi)源蛋白酶最適反應(yīng)pH和溫度的確定 將內(nèi)源蛋白酶加入到 pH1～14的緩沖液中，采用福林－酚法測定酶活力。不同pH的選擇性緩沖液分別為:0.1mol/L KCl－HCl緩沖液(pH1.0～2.0);0.1mol/L檸檬酸－Na2HPO4緩沖液(pH3.0～6.0);0.05mol/L Tris－HCl緩沖液(pH7.0～9.0);0.05mol/L硼砂－NaOH緩沖液(pH10.0);0.2mol/L Na2HPO4－NaOH緩沖液(pH11.0～14.0)。

將內(nèi)源蛋白酶加入到pH2.0、5.0、8.0和12.0的緩沖液中，分別在 20、30、40、50、60、70℃的水浴中準確反應(yīng)40min，酶活力測定采用福林－酚法。

1.2.3 內(nèi)臟蛋白的酶解工藝 精確稱取一定量的刺參內(nèi)臟，用蒸餾水勻漿，混合均勻，用1mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)至設(shè)定pH，加入一定量的蛋白酶后調(diào)節(jié)至設(shè)定溫度，內(nèi)源蛋白酶酶解直接設(shè)定至對應(yīng)溫度，攪拌，開始水解，反應(yīng)至設(shè)定時間。水解結(jié)束后，沸水浴滅酶活10min，終止反應(yīng)，然后冷卻至室溫，置于離心機中，8000r/min離心 30min，收集上清液。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 水解度測定 水解度(Degree of hydrolysis，DH)的測定采用茚三酮比色法。蛋白含量測定采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5－2010)。

1.2.4.2 氮回收率的測定 對原料進行水解，記錄水解離心后上清液的總體積，取15.0mL蛋白水解液，用凱氏定氮法消化、定氮，測定上清液中氮含量，氮回收率(Nitrogen recovery，NR)公式如下:

式中:NR－氮回收率(%);C0－底物總氮含量(g)，C1－上清液總氮含量(g)。

1.2.4.3 酶解液對羥自由基的清除作用［6］在刻度試管中加入0.8mL的HAc－NaAc緩沖液(pH5.0)，1.0mL的孔雀綠溶液(1 ×10－4mol/L)，2.2mL 的EDTA－Fe2+溶液(2 ×10－2mol/L)，1.4mL 體積分數(shù)0.3% 的H2O2溶液，用去離子水稀釋至10mL并搖勻，放置45min后在617nm下測定吸光度Ab，同時測定不加H2O2時體系在617nm下的吸光度A0，則羥自由基的產(chǎn)生量為ΔA=A0－Ab。ΔA越大，表示生成的羥自由基越多。

上述體系中加入H2O2之前加入1mL待測樣品，測定其吸光度As，則羥自由基的清除率(Scavenging rate of hydroxyl radical，SRHR)為:

1.2.4.4 酶解液對超氧陰離子自由基的清除作用［7］

取50mmol/L 的 Tris－HCl緩沖液(pH8.2，2mmol/L Na2EDTA)3mL，加入0.5mL待測酶液，于25℃保溫10min，然后加入25℃預(yù)溫的5mmol/L的鄰苯三酚(預(yù)先用 10mmol/L HCl配制)0.1mL，反應(yīng) 4min，每30s測定一次溶液在320nm下的吸光度，計算鄰苯三酚自氧化速率，以10mmol/L HCl作為空白調(diào)零。按照下式計算超氧陰離子的清除率(Scavenging rate of superoxide anion radical，SRSAR)。

式中:V0:未加待測樣品的反應(yīng)液中鄰苯三酚自氧化速率。Vs:加入加待測樣品的反應(yīng)液中鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.5 酶解工藝優(yōu)化 分別選取八種外源蛋白酶(中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶)和內(nèi)源蛋白酶對刺參內(nèi)臟蛋白進行水解，測定酶解液對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率、水解度和氮回收率。表1所示為八種蛋白酶水解反應(yīng)參數(shù)。選取酶解作用較強的蛋白酶，應(yīng)用正交實驗對其水解條件進行優(yōu)化，確定其最佳酶解工藝條件。正交實驗因素與水平見表2。

表1 八種蛋白酶水解反應(yīng)參數(shù)Table 1 Parameters for enzymatic hydrolysis of eight enzymes

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源蛋白酶最適反應(yīng)pH和溫度的確定

2.1.1 最適反應(yīng)pH的確定 圖1顯示了從刺參內(nèi)臟提取的內(nèi)源蛋白酶以酪蛋白為底物時不同pH下的酶活力變化，可以發(fā)現(xiàn)蛋白酶活力曲線出現(xiàn)高低不同的起伏，可能是由于內(nèi)臟中含有多種蛋白酶，不同的蛋白酶在不同的pH條件下表現(xiàn)出不同的活力。在pH2.0時，蛋白酶可能為類胃蛋白酶，表現(xiàn)出最大酶活力，這不同于啟航等報道的海參體壁粗蛋白酶在pH5.0時酶活力達到最大值［8］。隨著pH的增大，該酶液在pH5.0、8.0和12.0均有活性峰，表明至少有三種蛋白酶存在，最適pH5.0的酶可能為一種組織蛋白酶，最適pH8.0和12.0的酶為兩種堿性蛋白酶。上述結(jié)果與Fu等從海參消化道中提取的蛋白酶的實驗結(jié)果類似［5］。

表2 菠蘿蛋白酶正交實驗因素與水平L9(34)Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design L9(34)

圖1 pH對刺參內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶酶活力的影響Fig.1 Effect of pH on the proteolytic activity of endogenous enzyme extracted from sea cucumber viscera

2.1.2 最適反應(yīng)溫度的確定 由圖2可知，刺參內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶活力均隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度進一步升高時，由于蛋白的熱變性作用蛋白酶活力逐漸降低［9］。在 pH2.0的條件下，內(nèi)源蛋白酶在40～70℃之間酶活力較高，在60℃時酶活力達到最大值;在pH5.0時，酶活力最高點出現(xiàn)在55℃;在pH8.0和12.0的條件下，內(nèi)源蛋白酶的最適溫度分別為45℃和50℃。

圖2 溫度對刺參內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on the proteolytic activity of endogenous enzyme extracted from sea cucumber viscera

2.2 水解用酶的篩選

由于蛋白酶的酶切位點不同，所以蛋白酶的種類對多肽品質(zhì)具有重要影響［10］。Zhou等研究指出鮑魚內(nèi)臟蛋白酶酶解液的水解度、氨基酸組成和抗氧化活性均與所采用的蛋白酶有關(guān)［11］。因此，實驗中我們對水解刺參內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽所用的蛋白酶進行了篩選。由于內(nèi)源蛋白酶和外源蛋白酶水解蛋白各有優(yōu)缺點，因此我們分別用這兩類蛋白酶對內(nèi)臟蛋白進行了水解，對水解液的清除自由基活性、水解度和氮回收率進行了研究，篩選出最佳用酶。

海參內(nèi)臟和體壁含有豐富的內(nèi)源蛋白酶，在一定條件下能水解自身蛋白，即發(fā)生自溶。用內(nèi)源蛋白酶水解自身蛋白具有成本低的優(yōu)點，因此在實際生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用。但是內(nèi)源蛋白酶酶活力受到原料貯藏環(huán)境的影響，并且酶解過程的可控性和重現(xiàn)性較差［12］。本實驗分別在內(nèi)源蛋白酶最適pH和對應(yīng)的最適溫度下對內(nèi)臟蛋白酶解4h，對酶解液的清除自由基活性、水解度和氮回收率進行了測定，結(jié)果如圖3所示。在pH8.0時，酶解液的清除自由基活性、水解度和氮回收率均明顯高于在其它條件下(p＜0.05)，由此可以確定pH為8.0和溫度為45℃是內(nèi)源蛋白酶酶解內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽的最佳條件。在此條件下，所得酶解液對羥自由基和超氧陰離子自由基清除率分別為47.67%和24.98%。上述結(jié)果表明內(nèi)源蛋白酶可對內(nèi)臟蛋白進行有效酶解，所得酶解液具有一定的清除自由基活性。

圖3 內(nèi)源蛋白酶對刺參內(nèi)臟蛋白酶解液的清除羥自由基和超氧陰離子自由基活性、水解度和氮回收率的影響Fig.3 Effect of endogenous proteases on the scavenging rate of hydroxyl and superoxide anion radical，degree of hydrolysis and nitrogen recovery of hydrolysates prepared from sea cucumber viscera.

用外源蛋白酶酶解是目前常用的制備生物活性肽的方法。它不僅具有酶解過程可控性和重現(xiàn)性較好的優(yōu)點，而且可供使用的蛋白酶種類也比較多，但是往往增加了生產(chǎn)成本［13］。本實驗選用八種常用蛋白酶對內(nèi)臟蛋白進行酶解，在各酶活力最高條件下水解4h，測定水解物的清除自由基活性、水解度和氮回收率，實驗結(jié)果見圖4。八種酶解液均具有清除羥自由基和超氧陰離子自由基活性，其中菠蘿蛋白酶酶解液對羥自由基的清除率為63.04%，明顯高于其它蛋白酶(p＜0.05);其清除超氧陰離子自由基活性與木瓜酶和酸性酶酶解液相當(dāng)，明顯高于胰酶、風(fēng)味酶、胃酶、中性酶和堿性酶酶解液(p＜0.05)。由圖4(B、C)還可以看出菠蘿蛋白酶酶解液的水解度和氮回收率分別為25.50%和74.29%，與其它蛋白酶相比均處于較高水平。因此，從酶解液的清除自由基活性、水解度和氮回收率來看，菠蘿蛋白酶是水解刺參內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽的最佳用酶，這主要與該酶的酶切位點有關(guān)［14］。

圖4 外源蛋白酶對刺參內(nèi)臟蛋白酶解液的清除羥自由基和超氧陰離子自由基活性、水解度和氮回收率的影響Fig.4 Effect of endogenous proteases on the scavenging rate of hydroxyl and superoxide anion radical，degree of hydrolysis and nitrogen recovery of hydrolysates prepared from sea cucumber viscera.

2.3 菠蘿蛋白酶酶解工藝條件的優(yōu)化

通過料液比單因素實驗確定菠蘿蛋白酶酶解刺參內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽的最適料液比為1∶9;由加酶量和酶解時間單因素實驗可知二者的較好水平分別為4.0g/100g和2h;生產(chǎn)廠家提供菠蘿蛋白酶的最適酶解pH為6.8，最適酶解溫度為45℃。以上述條件為基礎(chǔ)，以pH、溫度、加酶量和酶解時間為主要因素，以清除羥自由基和超氧陰離子自由基活性為指標，采用正交設(shè)計確定最佳反應(yīng)條件。菠蘿蛋白酶正交實驗結(jié)果分析見表3。

由表3可知，用菠蘿蛋白酶酶解刺參內(nèi)臟蛋白時，以清除羥自由基活性為指標，對正交實驗結(jié)果進行極差分析，發(fā)現(xiàn)各因素的影響程度依次為酶解時間、pH、溫度和加酶量;最佳實驗組合為A3B1C3D1，即pH為7.8，溫度為35℃，加酶量為5.0g/100g，酶解時間為1h。以清除超氧陰離子自由基活性為指標，對正交實驗結(jié)果進行極差分析發(fā)現(xiàn)溫度對其影響最大，其余依次為酶解時間、加酶量和pH;最佳實驗組合為 A1B2C3D2，即 pH 為 5.8，溫度為45℃，加酶量5.0g/100g，時間為2h。上述兩個最佳組合并未出現(xiàn)在正交表中，需要對其進行驗證實驗。采用兩組優(yōu)化工藝參數(shù)對刺參內(nèi)臟蛋白進行酶解反應(yīng)，酶解液對羥自由基的清除率分別為79.15%和56.96%，二者具有顯著性差異(p＜0.05);對超氧陰離子自由基清除率分別為28.57%和35.71%，二者沒有顯著性差異(p＞0.05)。由表3發(fā)現(xiàn)，菠蘿蛋白酶在實驗2的條件下酶解刺參內(nèi)臟蛋白，所得酶解液對超氧陰離子自由基清除率明顯高于兩個最優(yōu)組合條件下的，但是其對羥自由基的清除率要低得多。實驗中測定酶解液對羥自由基的清除率時需將酶解液稀釋4～8倍，而測定其對超氧陰離子自由基清除率時不需稀釋，因此在確定最優(yōu)水解條件時以酶解液對羥自由基的清除率為主要指標。綜上所述，本研究確定菠蘿蛋白酶水解刺參內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽的最佳實驗條件為pH7.8、溫度35℃、加酶量5.0g/100g、酶解時間1h，在此條件下酶解液對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為79.15%和28.57%，明顯高于內(nèi)源蛋白酶在最適pH和溫度條件下水解內(nèi)臟蛋白得到的酶解液對自由基的清除率。由此可以看出外源蛋白酶是酶解刺參內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽的較好途徑，這可能與外源蛋白酶的多樣性和加酶量的可控性有關(guān)。

3 結(jié)論

刺參內(nèi)臟中至少有四種蛋白酶存在，其最適反應(yīng)pH分別為2.0、5.0、8.0和12.0，以pH2.0條件下的酶活力最高，相對應(yīng)的最適反應(yīng)溫度分別為60、55、45、50℃。內(nèi)源蛋白酶在pH8.0、溫度45℃的條件下酶解刺參內(nèi)臟蛋白，所得酶解液對羥自由基和超氧陰離子自由基清除率較高，分別為47.67%和24.98%。通過外源蛋白酶篩選實驗確定菠蘿蛋白酶為水解內(nèi)臟蛋白制備抗氧化肽的最佳用酶，由正交實驗確定其最適酶解條件為pH7.8、溫度35℃、加酶量5.0g/100g、酶解時間1h，該條件下得到的酶解液對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為79.15%和28.57%。綜上所述，由刺身內(nèi)臟酶解制備的多肽表現(xiàn)較好的清除自由基的能力，作為功能因子用于抗衰老保健品和化妝品具有巨大的開發(fā)潛力。

表3 菠蘿蛋白酶酶解條件正交實驗方案與結(jié)果分析Table 3 The design and results of orthogonal test of bromelain

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