紫杉烯合酶基因遺傳轉(zhuǎn)化金針菇的研究

康林芝，林俊芳，2，黃秀琴，郭麗瓊，2，*，梁 科

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系，廣東廣州510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能研究所，廣東廣州 510640）

金針菇（Flammulina velutipes（Fr.）sing）屬于典型木腐生菌類，以其菌蓋滑嫩、柄脆、營養(yǎng)豐富、味美適口而著稱于世。據(jù)測定，金針菇氨基酸的含量高于一般菇類，尤其是賴氨酸的含量特別高，而賴氨酸具有促進(jìn)兒童智力發(fā)育的功能，故金針菇也稱益智菇。同時(shí)，金針菇干品中含蛋白質(zhì)8.87%，碳水化合物60.2%，粗纖維7.4%，經(jīng)常食用可防治潰瘍病。金針菇既是一種美味食品，又是較好的保健食品[1]。金針菇基因工程方面的研究也有所報(bào)道，張介馳等[2]克隆了金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DES（BI21），經(jīng)IPIG誘導(dǎo)該基因在大腸桿菌DES（BI21）中獲得了大量表達(dá)。楊培周等[3]克隆了金針菇gpd-Fv啟動(dòng)子；Cheng等[4]用金針菇gpd啟動(dòng)子與多功能纖維素酶基因連接構(gòu)建了表達(dá)載體pgFvs-mfc轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘，得到了高效表達(dá)多功能纖維素酶的轉(zhuǎn)化子。Kuo等[5]利用電擊法將EGFP（增強(qiáng)綠色熒光蛋白）基因轉(zhuǎn)化金針菇，EGFP得到了穩(wěn)定表達(dá)。Maehara等[6]利用金針菇gpd啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化金針菇比以trpⅠ為啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化金針菇效率提高了3倍。紫杉醇是四環(huán)二萜酰胺類化合物，是來源于紅豆杉的重要臨床抗癌藥物，其生物合成的研究在新藥開發(fā)上具有重要意義。紫杉醇生物合成是從二萜類共同前體香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）開始，紫杉烯合酶（taxadiene synthase，TS），是紫杉醇生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化GGPP形成紫杉二烯。Huang等[7]將異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶（taxadiene synthase）共轉(zhuǎn)化E.coli，實(shí)驗(yàn)證明紫杉二烯可以在體內(nèi)合成，且紫杉二烯的產(chǎn)量最大可達(dá)到1.3mg/L；在紫杉醇單基因異源表達(dá)的研究上，Anterola等[8]將紫杉二烯合酶基因?qū)胩μ\類植物physcomitrella patens中進(jìn)行異源表達(dá)，成功獲得目的產(chǎn)物，這使紫杉醇的代謝合成成為可能。而紫杉烯合酶基因（ts）在大型真菌金針菇中的表達(dá)尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

金針菇菌株FV－1（Fla7）購買于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種廠，子實(shí)體為純黃色；表達(dá)載體pgFvs－Ts含有金針菇內(nèi)源性gpd－fvs啟動(dòng)子和紫杉烯合酶（Ts）基因，表達(dá)載體pgFvs－h(huán)ph含有金針菇內(nèi)源性gpd－fvs啟動(dòng)子和潮霉素磷酸脫氫酶（hph）基因，兩個(gè)表達(dá)載體均為本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建，表達(dá)質(zhì)粒圖譜如圖1所示；MYG固體培養(yǎng)基配方 麥芽糖10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，瓊脂粉20g，pH自然，溶于水中，加水至總體積為1L；MYG液體培養(yǎng)基的配制方法 MYG固體培養(yǎng)基中去掉瓊脂粉；溶壁酶（Lywallzyme）購自廣東省微生物研究所；潮霉素（Hygromycin B，HmB）美國Roche公司產(chǎn)品：PCR擴(kuò)增試劑盒、RT－PCR擴(kuò)增試劑盒 購自上海生工生物技術(shù)公司。

圖1 表達(dá)質(zhì)粒pgFvs－h(huán)ph（左）和pgFvs－Ts（右）圖Fig.1 The expression vectors of pgFvs－Ts（left）and pgFvs－h(huán)ph（right）

1.2 金針菇原生質(zhì)體的制備與再生

參照陳力力等[9]和周付忠等[10]的方法進(jìn)行。

1.3 金針菇總DNA、RNA的提取

金針菇總DNA的提取參照Wang等[11]和白永宏等[12]的方法進(jìn)行。金針菇總RNA的提取參照張潔等[13]的方法進(jìn)行。

1.4 PCR引物

根據(jù)紫杉烯合酶基因（taxadiene synthase）的核苷酸序列設(shè)計(jì)了一對引物，擬擴(kuò)增的片段大小為657bp，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物為：

上游引物巢式TS1：5’－ACA CCG TTT CGT GAG AGT TCT－3’（21bp）；

下游引物巢式TS2：5’－CAT CAG TAC ACA GGC AGT GGA－3’（21bp）。

1.5 PEG轉(zhuǎn)化法

參照郭麗瓊等[14]轉(zhuǎn)化灰樹花（Pleurotus ostreatus）、李剛等[15]轉(zhuǎn)化靈芝（Ganoderma lucidum）的方法，并進(jìn)行改良。

將制備好的新鮮金針菇原生質(zhì)體懸浮于40μL MMC buffer（25mL 1mol/L甘露醇溶液，12.5mL 0.2mol/L Maleate buffer，1.25mL 1mol/L CaCl2，11.25mL無菌去離子水）和10μL PEG buffer（25%PEG4000，10mmoL/L CaCl2，10mmoL/L Tris，pH7.4）中，使其終濃度為1×108個(gè)/mL；然后將質(zhì)粒pgFvs－Ts和pgFvs－h(huán)ph共轉(zhuǎn)化金針菇原生質(zhì)體，質(zhì)粒各3～5μg，另設(shè)一管不加質(zhì)粒作為對照；并于每管中各加入12.5μL PEG buffer，冰浴20min；然后再加入0.5mL PEG buffer，混勻后28℃溫育15min；之后加入1.0mL STC buffer，4000r/min離心15min沉淀原生質(zhì)體，最后重新懸浮原生質(zhì)體于500μL MYG再生培養(yǎng)基中。25℃靜置培養(yǎng)3d，涂布含有60μg/mL潮霉素（HmB）的MYG再生平板。一般5～10d后轉(zhuǎn)化子在抗性平板上長出。

1.6 轉(zhuǎn)化子的分子生物學(xué)方法鑒定

質(zhì)粒的提取與純化、PCR、RT－PCR等技術(shù)的操作，均根據(jù)分子克隆進(jìn)行[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇擬轉(zhuǎn)化子的篩選

用pgFvs－Ts和pgFvs－h(huán)ph質(zhì)粒轉(zhuǎn)化金針菇FLa7，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在再生液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)3d后涂布于含有60μg/mLHmB的MYG再生平板上，于25℃培養(yǎng)5d后，便可見到60個(gè)左右的再生菌落的出現(xiàn)（如圖2中A平板所示），而對照平板上（涂有不加pgFvs－Ts和pgFvs－h(huán)ph質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化液的平板）則未長出菌落（如圖2中B平板所示）。將擬轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到含有75μg/mL HmB的MYG平板進(jìn)行二次篩選，在含有75μg/mL HmB的再生篩選培養(yǎng)基上，只有成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pgFvs－Ts和質(zhì)粒pgFvs－h(huán)ph的共轉(zhuǎn)化子或只轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pgFvshph的單轉(zhuǎn)化子才可以正常生長，經(jīng)過二次篩選有18個(gè)轉(zhuǎn)化子可以在含有75μg/mL HmB的再生篩選培養(yǎng)基上生長。

圖2 金針菇擬轉(zhuǎn)化子在含有75μg/mL HmB的MYG平板上的生長情況Fig.2 The phenotype of putative transformants of Flammulina velutipes growing on MYG plate with 75μg/mL hygromysine

2.2 擬轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定分析

為了初步檢測質(zhì)粒pgFvs－Ts是否轉(zhuǎn)入金針菇中。將上述18個(gè)擬轉(zhuǎn)化子，提取其總DNA，用合成的引物（詳見1.4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳。部分結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，有與陽性質(zhì)粒擴(kuò)增得到的條帶大?。s657bp）一致的轉(zhuǎn)化子，與所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增的理論值657bp相符。說明該轉(zhuǎn)化子的基因組中已經(jīng)含有ts基因片段，而沒有擴(kuò)增出特異條帶的轉(zhuǎn)化子可能只有潮霉素基因（hph）的轉(zhuǎn)入。

圖3 金針菇擬轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplif ication of genomic DNA from putative transformants

PCR結(jié)果顯示18個(gè)擬轉(zhuǎn)化子中有8個(gè)擬轉(zhuǎn)化子可擴(kuò)增出657bp的目的條帶，與陽性對照的PCR電泳條帶大小相符。金針菇原種的陰性對照中無電泳條帶，因此初步判定紫杉烯合酶基因已經(jīng)成功重組進(jìn)入擬轉(zhuǎn)化子的基因組中。在18個(gè)擬轉(zhuǎn)化子中共有8個(gè)轉(zhuǎn)化子同時(shí)整合了紫杉烯合酶基因和hph基因，說明本實(shí)驗(yàn)的共轉(zhuǎn)化率為44.44%。

2.3 轉(zhuǎn)化子的RT-PCR分析檢測

為了證明上述8株轉(zhuǎn)化子所擴(kuò)出的條帶不是由于PCR擴(kuò)增過程中某些因素導(dǎo)致的假陽性帶，將PCR鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子菌絲體分別轉(zhuǎn)接，通過抽取總RNA，消化基因組DNA，分離mRNA，合成cDNA，以設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT－PCR部分結(jié)果如圖4所示。

圖4 金針菇擬轉(zhuǎn)化子的RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 RT－PCR amplification of cDNA from putative transformants

RT－PCR結(jié)果顯示（圖4）經(jīng)PCR鑒定正確的8個(gè)擬轉(zhuǎn)化子有7個(gè)擬轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)增出657bp的目的條帶，證明已經(jīng)整合進(jìn)宿主染色體中的目的基因?qū)崿F(xiàn)正確轉(zhuǎn)錄。其中泳道8沒有擴(kuò)增出對應(yīng)條帶，陰性對照無條帶，說明這8株擬轉(zhuǎn)化子有7株紫杉烯合酶基因在轉(zhuǎn)錄水平能夠正常進(jìn)行，而其中一株可能是由于插入位點(diǎn)不同引起基因沉默，沒有轉(zhuǎn)錄。這表明用PCR方法從轉(zhuǎn)化株擴(kuò)增出的帶，確實(shí)是質(zhì)粒pgFvs－Ts中的ts基因片斷而不是PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的非特異性帶。通過潮霉素篩選實(shí)驗(yàn)以及PCR、RT－PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明已經(jīng)有7株轉(zhuǎn)化子已將外源質(zhì)粒pgFvs－Ts和pgFvs－Hph轉(zhuǎn)化進(jìn)了金針菇中。

2.5 金針菇轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性

將PCR鑒定和RT－PCR鑒定正確的7株陽性轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子先在不含HmB的MYG平板上連續(xù)傳代5代后，再接種到一個(gè)含有75μg/mL HmB的MYG平板上培養(yǎng)，5d后7株金針菇轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子在抗性板上生長情況如圖5所示。從圖5可以看出，7株抗性轉(zhuǎn)化子在沒有選擇壓力的情況下，經(jīng)連續(xù)多次傳代后都沒有喪失HmB抗性，初步證明它們都是穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。

圖5 7株金針菇轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含有75μg/mLHmB的MYG平板上生長5d后的結(jié)果Fig.5 The phenotype of transformants growing on the MYG plate with 75μg/mL hygromysine for 5 days

3 討論

金針菇是可食用的大型真菌，是健康的功能性食品，用其作為轉(zhuǎn)化表達(dá)的受體安全性較高，容易被廣大消費(fèi)者接受；日本學(xué)者報(bào)道了從金針菇菌絲體中分離得到的4個(gè)側(cè)柏烯類型的倍半萜[17－18]，而且由圖6[19]可以看出，二萜類共同前體GGPP與倍半萜的合成具有共同的前體物質(zhì)法尼基焦磷酸，正是由于倍半萜與二萜化合物合成具有部分相同或類似的代謝流，所以本文嘗試?yán)媒疳樄疆愒幢磉_(dá)紫杉醇生物合成重要酶基因ts，結(jié)果表明了外源ts基因在金針菇轉(zhuǎn)化子中能夠正常轉(zhuǎn)錄，這為以后多基因組合導(dǎo)入金針菇生產(chǎn)紫杉醇提供了基礎(chǔ)，但是利用多基因組合轉(zhuǎn)化金針菇需要進(jìn)一步的研究與探討。

金針菇菌絲每個(gè)細(xì)胞中含有兩個(gè)核，要獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，需要進(jìn)行至少3次的高濃度潮霉素的抗性篩選。本研究在初篩時(shí)采用60μg/mL的潮霉素進(jìn)行篩選，之后把擬轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到潮霉素濃度為75μg/mL的培養(yǎng)基上進(jìn)行多次篩選，獲得的穩(wěn)定遺傳的金針菇轉(zhuǎn)化子。

本實(shí)驗(yàn)采用PEG介導(dǎo)法共轉(zhuǎn)化金針菇的原生質(zhì)體，共轉(zhuǎn)化過程中兩個(gè)表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)化率較低，利用潮霉素抗性作為選擇標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，容易出現(xiàn)不含有紫杉烯合酶基因的陽性轉(zhuǎn)化子，這種現(xiàn)象在共轉(zhuǎn)化過程中難以避免。提高共轉(zhuǎn)化率的方法有待進(jìn)一步研究探索。

圖6 由異戊二烯焦磷酸生成萜類化合物的途徑[19]Fig.6 The biosynthesis pathway of terpenoid from Isoprene pyrophosphoric（IPP）

本研究通過轉(zhuǎn)基因金針菇連續(xù)繼代5代后對潮霉素抗性的檢測以及PCR擴(kuò)增對目的基因的檢測，結(jié)果表明整合進(jìn)金針菇的外源抗性基因hph和目的ts基因可以在金針菇中穩(wěn)定遺傳，這說明金針菇作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)是可行的。

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