吡咯列酮與瑞舒伐他汀聯合使用對大鼠胸主動脈外膜成纖維細胞氧化和炎癥的保護作用

陶楊晨，繆培智，趙莉芳，高平進，顧水明

(1.江蘇大學臨床醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江212001;2.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院心內科，上海200031;3.上海市瑞金醫(yī)院高血壓研究所，上海200031)

血管外膜成纖維細胞(adventitial fibroblast，AF)被激活后能夠發(fā)生表型轉化，從而具有增殖和遷移的功能，參與高血壓新生內膜的形成和血管重構［1-3]。血管重構是高血壓靶器官損害的病理基礎，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，而氧化和炎癥反應是導致血管重構的主要因素。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators activated receptor ，PPAR)γ 是一種核受體，被配體激活后可調節(jié)靶基因的轉錄。多項研究證實PPARγ 激活對心血管疾病發(fā)揮有益的作用，如抑制平滑肌細胞的增殖和AF 的遷移等。他汀類藥物具有抗氧化和抗炎的特性［4]。故聯合使用PPARγ 激動劑和他汀類藥物能更有效地對抗心血管病變。本研究通過體外實驗探討PPARγ 激動劑吡咯列酮與他汀類藥物瑞舒伐他汀聯合應用對血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的血管氧化及炎癥反應的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 細胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶等均購自Gibco 公司，培養(yǎng)皿購自Coming 公司，AngⅡ、吡格列酮購自Sigma 公司，瑞舒伐他汀鈣購自大連美侖生物有限公司，RT-PCR 反應試劑盒購自Promega 公司，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞型一抗購自Santa Cruz 公司，二抗購自Amersham Life Sciences 公司，電泳遷移材料及轉錄因子探針購自Invitrogen 公司，PPARγ 及GAPDH引物由上海生物工程公司合成，SD 大鼠由上海市實驗動物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取8 周齡的雄性SD 大鼠，分離胸主動脈外膜，將其剪碎，貼片于培養(yǎng)皿底部，用含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)AFs，實驗使用傳代培養(yǎng)至第4 代的細胞。

1.2.2 蛋白質印跡法檢測NADPH 氧化酶亞型待AFs 長至亞融合狀態(tài)時，以無血清DMEM 處理24 h。實驗分成5 組進行:對照組，AngⅡ組(濃度為10-6mol/L)，PPARγ 激動劑干預組:吡咯列酮(濃度為10 ×10-6mol/L)+AngⅡ，他汀類藥物干預組:瑞舒伐他汀(濃度為10 ×10-6mol/L)+AngⅡ，聯合用藥組:吡咯列酮+瑞舒伐他汀+AngⅡ(濃度同上)。AngⅡ誘導24 h，干預組藥物在AngⅡ誘導前0.5 h 加入。收集上清及細胞，提取細胞總蛋白，BCA 法蛋白定量，取50 μg 蛋白與上樣緩沖液變性后經聚丙烯酰胺凝膠電泳，4 ℃100 V 2 h 轉膜，麗春紅染色觀察轉移效果。5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃一抗孵育過夜(稀釋倍數分別為羊抗-p22phox，1 ∶200;羊抗-p67phox，1 ∶200)，TBST 洗3 次，每次10 min，結合辣根過氧化物酶標記的兔抗羊的二抗(1 ∶5000 稀釋)，室溫孵育1 h，TBST 洗3 次。用蛋白質印跡熒光檢測試劑盒顯示于X 線片上。用Alphalmager 3400 Imaging 圖像分析系統掃描膠片，以對照組的面積灰度值為100%與實驗組進行比較分析。實驗重復3 次。

1.2.3 電泳遷移 實驗分組及藥物干預處理同“1.2.2”。收集細胞，提取細胞核。設定的互補寡核苷酸序列:NF-κB，5＇-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3＇;AP-1，5＇-CGCTTGATGACTCAGCCCGAA-3＇。用［γ-32P]ATP，并在T4多聚核苷酸激酶的作用下標記探針，放射性標記探針與細胞核提取物在室溫下、50 mmol/L Tris·HCl 緩沖液(pH =7.5)中共同孵育30 min。6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離脫氧核糖核酸蛋白復合物，在干膠儀器上干燥凝膠，然后用X 光片壓片檢測。

1.2.4 RT-PCR 測定PPARγ mRNA 待AFs 長至亞融合狀態(tài)時，以無血清DMEM 處理24 h。實驗分成4 組進行:對照組，瑞舒伐他汀組(濃度為10 ×10-6mol/L)，吡咯列酮組(濃度為10 ×10-6mol/L)，瑞舒伐他汀+吡咯列酮組(濃度同上)。藥物誘導24 h 后收集各組細胞，提取總RNA，取2 μg 逆轉錄為cDNA。設計PPARγ 引物序列:上游5＇-TGTGAAGCCCATTGAAGACA-3＇，下 游5＇-GAGCGGGTGAAGACTCATGT-3＇，擴增片段長度為199 bp。RTPCR 反應條件:95 ℃溫育15 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán);同時設GAPDH 內參基因。反應結束后取反應產物6 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。用Alphalmager 3400 Imaging 圖像分析系統采集并處理電泳圖，以目的基因與GAPDH 基因灰度比值代表目的基因的表達水平。實驗重復3 次。

1.3統計學方法

2 結果

2.1 吡咯列酮和瑞舒伐他汀對AngⅡ誘導NADPH氧化酶的作用

見圖1，與對照組相比，Ang Ⅱ顯著增加NADPH氧化酶兩個關鍵亞型p22phox和p67phox的表達(P＜0.01);與AngⅡ組相比，瑞舒伐他汀單獨預處理組沒有明顯抑制AngⅡ的這種誘導作用(P＞0.05)，而吡咯列酮單獨預處理組明顯抑制氧化酶表達(P＜0.01 或P＜0.05)，并且該兩種藥物合用更顯著地抑制了AngⅡ誘導的NADPH 氧化酶亞型表達(P＜0.01)。

2.2 吡咯列酮和瑞舒伐他汀對AngⅡ誘導轉錄因子的作用

見圖2，與對照組相比，AngⅡ組顯著增加轉錄因子NF-κB 和AP-1 的活性，吡咯列酮預處理組可明顯抑制NF-κB 的活性，而瑞舒伐他汀預處理組能明顯抑制AP-1 的活性，吡咯列酮和瑞舒伐他汀聯合使用能顯著抑制AngⅡ誘導的NF-κB 及AP-1 的活性。

圖2 吡咯列酮和瑞舒伐他汀對AngⅡ誘導轉錄因子的作用Fig 2 Ang Ⅱ-induced transcription factors and modulation by pioglitazone and rosuvastatin

2.3 瑞舒伐他汀對PPARγ 表達的影響

見圖3，與對照組相比，瑞舒伐他汀與吡咯列酮單獨使用或兩者聯合應用均能顯著地增加PPARγ mRNA 的表達(P＜0.01)，而瑞舒伐他汀與吡咯列酮聯合應用則更能明顯地增強PPARγ 的表達水平(P＜0.05)。

圖3 瑞舒伐他汀對PPARγ mRNA 表達的影響Fig 3 The effect of rosuvastatin on PPARγ

3 討論

隨著對高血壓發(fā)病機制的研究和降壓藥物的發(fā)展，患者血壓的控制已經得到明顯改善，但其伴發(fā)的心、腦、血管、腎等靶器官的損害尚未得到很好的控制，因此靶器官損害已成為高血壓治療的一個新靶點。心臟和血管的重塑是靶器官損害的共同病理基礎。血管外膜成纖維細胞向內膜下遷移并增殖是血管重塑的重要發(fā)生機制之一，已知多種血管活性物質如轉化生長因子β1等均可促進AF 遷移活性增強，其中AngⅡ是導致血管重構的重要因子。Reddy 等［5]報道血管外膜存在RAAS 系統，而且外膜在受到損傷刺激后血管緊張素轉換酶被激活。Ang Ⅱ通過血壓依賴或不依賴的途徑引起炎癥，并通過增強氧化應激［6]和血管通透性等機制加速心血管的重塑。

許多研究已經證實，由活性氧自由基(ROS )所導致的氧化應激(OS )是心血管疾病發(fā)生的病理生理基礎的關鍵。許多酶可以誘導產生ROS，包括NADPH 氧化酶等，而在心血管系統中，NADPH 氧化酶是血管組織主要的氧化酶，是血管組織活性氧的主要來源，p22phox和p67phox是NADPH 氧化酶的兩個關鍵亞型部件。有研究認為，血管外膜AFs 的NADPH 氧化酶可能是血管病變和重塑的先驅及啟動者［7-8]。本研究結果表明PPARγ 激動劑吡咯列酮明顯抑制AngⅡ誘導的NADPH 氧化酶亞型的表達，且兩種藥物合用時這種抑制作用更明顯。

炎癥反應在血管損傷后的修復中起到關鍵作用，以往一直認為血管損傷后的炎癥反應是由內膜引發(fā)，并由內向外發(fā)展。但近期有研究指出在內膜增生前，外膜成纖維細胞就能合成并分泌炎癥因子和趨化因子，這與其增殖、遷移以及表型轉化等密切相關［9]。AFs 還可以通過釋放活性氧、各種細胞因子、基質金屬蛋白酶等來影響炎癥反應，多種炎癥因子相互作用引起外膜炎癥從而影響新生內膜形成和血管重塑。本研究結果顯示PPARγ 激動劑吡咯列酮明顯抑制由AngⅡ刺激產生的轉錄因子NF-κB 的活性，瑞舒伐他汀可抑制AP-1 的活性，并且兩種藥物合用效果更佳，而大部分的炎癥因子正是由NFκB、AP-1 等轉錄因子介導產生的。

有研究證明他汀類藥物能夠通過環(huán)氧合酶(COX )-2 等途徑激活PPARγ 的表達，從而發(fā)揮抗炎作用［10]。本研究結果表明，他汀類藥物聯合應用PPARγ 激動劑后，與兩者單獨作用比較，可進一步激活PPARγ 的表達，表現出協同效應。這表明兩種藥物聯合應用可能更有效地控制血管的氧化和炎癥作用。本研究為PPARγ 激動劑和他汀類藥物控制心血管病變的臨床聯合用藥提供了理論依據。

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