谷氨酰胺對慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細(xì)胞中核因子-κB及IL-6的影響

居建剛 黃美健 周凌燕 湯曉燕 冷報浪 任娥

谷氨酰胺對慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細(xì)胞中核因子-κB及IL-6的影響

居建剛 黃美健 周凌燕 湯曉燕 冷報浪 任娥

目的 通過觀察谷氨酰胺（Gln）對慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中NF-κB活性和IL-6水平的影響，探討Gln在COPD患者治療中的抗炎作用。 方法 收集30例COPD患者在COPD急性加重期（AECOPD）和COPD穩(wěn)定期（SCOPD）的外周血PBMC各30例，各分為Gln組細(xì)胞培養(yǎng)時加入濃度為8 mmol/L的Gln和空白對照組，并以15例健康體檢者作為對照組。采用RT-PCR法測定5組外周血PBMC中NF-κBp65、IL-6基因的表達(dá)。 結(jié)果 健康對照組NF-κBp65、IL-6表達(dá)水平低于AECOPD空白對照組（均P＜0.01），與SCOPD空白對照組比較（均P＜0.05）。AECOPD Gln組與健康對照組NF-κBp65、IL-6比較有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而SCOPD Gln組NF-κBp65、IL-6與健康對照組比較無明顯差異（均P＞0.05）。AECOPD Gln組與空白對照組比較NF-κBp65、IL-6的表達(dá)明顯降低（均P＜0.05）。SCOPD空白對照組NF-κBp65、IL-6與Gln組比較表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 Gln可抑制COPD患者炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性，并下調(diào)IL-6的表達(dá)水平。

慢性阻塞性肺疾病 谷氨酰胺 單個核細(xì)胞 核因子-κB 白介素-6

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見病和多發(fā)病，患病率及死亡率均高，已經(jīng)成為社會的主要疾病負(fù)擔(dān)之一。COPD作為一種慢性病，其確切的發(fā)病機制尚未完全明了，目前普遍認(rèn)為COPD以氣道、肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征[1]，而在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中炎癥細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)錄起到非常重要的作用。因此如何對COPD患者炎癥進(jìn)行抑制是當(dāng)前眾多學(xué)者研究的熱點，本研究采用RT-PCR法，觀察谷氨酰胺（Gln）對COPD急性加重期（AECOPD）和COPD穩(wěn)定期（SCOPD）患者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中NF-κBp65、IL-6基因表達(dá)水平的影響，探討Gln在COPD治療中的抗炎作用。

1 對象和方法

1.1 對象 從2011年5月至2012年4月在本院呼吸內(nèi)科住院的AECOPD患者中篩選出30例，其中男18例，女12例，年齡54～75歲，平均（70.1±4.7）歲；均符合2007年COPD診治指南修訂版[2]（輕度5例，中度18例，重度7例）；并排除心腦血管系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)中的其他疾病、較嚴(yán)重的消化系統(tǒng)疾病、腎病、糖尿病等內(nèi)分泌代謝疾病、腫瘤以及重大手術(shù)和結(jié)締組織病等；SCOPD為上述30例患者經(jīng)抗感染、祛痰以及擴張支氣管等藥物治療10～20d臨床癥狀好轉(zhuǎn)，病情穩(wěn)定進(jìn)入緩解期；健康對照組為健康體檢者15例，男9例，女6例，年齡52～76歲，平均（68.4±6.9）歲；經(jīng)詢問病史及 X線檢查未患過重大疾病且在近1個月內(nèi)未患過呼吸系統(tǒng)疾病。所有納入研究的患者均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。COPD患者和健康對照組比較，性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗試劑及器材 人淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物公司)；無GInRPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（GIBCO公司）；L-Gln（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；Trizol（上海生物工程有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒定、定量試劑盒、DL2000 DNA Marker（寶生物工程（大連）有限公司）;ABI7500定量PCR儀（美國Pharmacia公司）。

1.2.2 PBMC的提取 清晨抽取研究對象靜脈血5ml，置于肝素抗凝管中，立即進(jìn)行分離。用磷酸鹽緩沖液（PBS）將人血稀釋至2倍。室溫下，將4ml淋巴細(xì)胞分離液加入15ml離心管，再將10ml人血稀釋液加入離心管，使其覆蓋于淋巴細(xì)胞分離液上。室溫下以1 500 r/ min離心15min，毛細(xì)吸管吸取中層PBMC，得到的PBMC以5倍體積PBS液洗滌、1 000r/min離心10 min，棄去上清液，底層為PBMC。

1.2.3 分組 提取的PBMC用無GlnRPMI1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2.0×106個/ml，健康對照組PBMC只用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。AECOPD患者平均分成兩組：（1）Gln組：患者的PBMC中加入濃度為8 mmol/L的Gln；（2）空白對照組：僅用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。SCOPD患者平均分成兩組：（1）Gln組：患者的PBMC中加入濃度為8 mmol/L的Gln；（2）空白對照組：僅用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。最后-80℃保存待測。

1.2.4 RT-PCR法檢測核因子-κB（NF-κB）p65、IL-6基因的表達(dá) 引物設(shè)計采用Primer 5.0引物設(shè)計軟件和引物設(shè)計原則進(jìn)行熒光引物的設(shè)計，然后由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成:NF-κBp65引物序列：上游5'-GCGAGAGGAGCACAGATACC-3′，下游5′-CTGATAGCCTGCTCCAGGTC-3′；IL-6引物序列：上游5′-AGGAGACTTGCCTGGTGAAA-3′，下游5′-CAGGGGTGGTTATTGCATCT-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游5′-GAAGATG GTGATGGGATTTC-3′；擴增長度分別為250、180和226bp。用Trizol法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，均按試劑盒說明操作。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR 12.5μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板2μl，最后ddH2O補充體積至25μl。反應(yīng)條件：94℃ 5min，94℃15s，60℃45s，循環(huán)擴增40次。60℃檢測熒光值。實驗樣本經(jīng)定量PCR得到Ct值后運用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量結(jié)果判讀。首先確立對照組，設(shè)定目標(biāo)基因在該對照組中表達(dá)水平為1，結(jié)果表達(dá)為實驗組目的基因表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)，其中△Ct=Ct目的基因-Ct管內(nèi)對照基因；△Ct值越高，表達(dá)水平越低。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 目的基因及內(nèi)參電泳圖 根據(jù)Marker指示，擴增條帶為目的條帶，電泳圖中無雜質(zhì)，說明PCR擴增為特異性擴增（見圖1）；實時熒光PCR擴增顯示各個引物擴增產(chǎn)物熔點曲線圖均具有單一主峰，表明引物熒光定量PCR擴增具有較強的特異性。

圖1 目的基因及內(nèi)參電泳圖（1：IL-6；2：NF-κB p65；3：GAPDH；M：Marker）

2.2 各組PBMC中NF-κBp65、IL-6△Ct值變化比較 見表1。

由表1可見，健康對照組NF-κBp65、IL-6表達(dá)水平與AECOPD空白對照組比較均明顯降低（均P＜0.01），與SCOPD空白對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。AECOPD Gln組與健康對照組NF-κBp65、IL-6比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。SCOPD Gln組NF-κBp65、IL-6與健康對照組比較均無明顯差異（均P＞0.05）。AECOPD Gln組與空白對照組比較NF-κBp65、IL-6的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。SCOPD空白對照組NF-κBp65、IL-6與Gln組比較表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 各組PBMC中NF-κBp65、IL-6△Ct值變化比較

3 討論

COPD是一種可以預(yù)防和可以治療的常見疾病,其特征是持續(xù)存在的氣流受限。氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展,伴有氣道和肺對有害顆?；驓怏w所致慢性炎癥反應(yīng)的增加[1]，急性加重和合并癥影響患者整體疾病的嚴(yán)重程度。COPD發(fā)病機制主要有肺部炎癥氧化/抗氧化失衡以及蛋白酶/抗蛋白酶的失衡,而眾多研究表明肺部炎癥反應(yīng)在COPD發(fā)病機制中具有重要作用，因此研究對COPD患者炎癥反應(yīng)的抑制和干預(yù)，已受到越來越多的關(guān)注。

NF-κB常以p65/p50異源二聚體的形式存在。在各種因素刺激下，NF-κB迅速激活，p65亞基進(jìn)入核內(nèi)直接作用于轉(zhuǎn)錄元件而激活轉(zhuǎn)錄過程，調(diào)節(jié)多個基因的轉(zhuǎn)錄，在先天免疫、炎癥反應(yīng)、組織纖維化和細(xì)胞凋亡中起重要作用[3]。而IL-6是介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，是炎癥免疫反應(yīng)的重要遞質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)IL-6顯著影響COPD的全身炎癥反應(yīng)，而呼吸困難、骨骼肌萎縮、胰島素抵抗、肺動脈高壓與其過度表達(dá)有關(guān)[4-5]。NF-κB有涉及并調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥的抗炎作用，其誘導(dǎo)和吸引炎性基因表達(dá)的作用在炎癥相關(guān)性疾病的治療中引起廣泛關(guān)注[6]。研究發(fā)現(xiàn)COPD患者或COPD動物模型的肺組織內(nèi)NF-κB活性顯著增加，而受NF-κB調(diào)控的TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子也明顯上調(diào)[7]?？梢奛F-κB能從上游調(diào)控COPD炎癥，是炎癥調(diào)節(jié)的樞紐和關(guān)鍵，其激活是COPD患者急性加重的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，抑制NF-κB活化可能會有效改善COPD的過程，這或許將成為治療COPD的一種新方法。

Gln是人體中的一種條件性必需氨基酸，是免疫系統(tǒng)的主要能源，具有廣泛的生物學(xué)活性，近年來有研究顯示，Gln能下調(diào)脂多糖（LPS）刺激下的人體PBMC中多種炎癥因子的過度表達(dá)[8]。Singleton等[9]對敗血癥小鼠治療的研究發(fā)現(xiàn)Gln能抑制NF-κB激活及細(xì)胞因子的表達(dá)，其Gln治療組顯著降低肺中TNF-a和IL-6的表達(dá)。另有研究也證實Gln可減少促炎性細(xì)胞因子如TNF-a和IL-6的釋放，提高膿毒癥動物的生存率[10]?；谏鲜龅难芯亢桶l(fā)現(xiàn)促使我們思考：能否從炎性反應(yīng)的角度，通過應(yīng)用Gln來抑制肺組織中NF-κB和IL-6等炎癥因子的表達(dá)而實現(xiàn)其抗炎作用，起到改善COPD患者癥狀的作用。

本研究運用Gln干預(yù)AECOPD患者治療前后外周血PBMC，并用Real-Time PCR法檢測PBMC中NF-κBp65、IL-6表達(dá)變化，Real-time PCR擴增電泳圖結(jié)果提示NF-κBp65、IL-6在COPD患者炎癥細(xì)胞上存在表達(dá)。正常對照組較AECOPD治療前后空白對照組表達(dá)量低，且急性加重期較穩(wěn)定期高，證實了NF-κBp65、IL-6在COPD急性加重期和穩(wěn)定期的長期存在，進(jìn)一步證明了COPD為一種慢性炎癥的實質(zhì)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)COPD急性加重期和穩(wěn)定期中空白對照組較Gln組的NF-κBp65、IL-6表達(dá)顯著升高，提示Gln可抑制COPD患者外周血PBMC中NF-κB活化，并減少炎癥介質(zhì)IL-6的釋放。同時AECOPD Gln組與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，而SCOPD Gln組與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與急性期炎癥細(xì)胞的表達(dá)較高，而穩(wěn)定期炎癥細(xì)胞較低及Gln的干預(yù)有關(guān)。目前國內(nèi)關(guān)于Gln對COPD患者PBMC中NF-κB及IL-6表達(dá)的影響還尚未見報道。本研究采用COPD患者外周血中PBMC為研究對象，應(yīng)用Gln干預(yù)COPD患者PBMC，觀察細(xì)胞中NF-κB和IL-6表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步明確了兩者參與COPD的炎癥反應(yīng)，為藥物治療COPD提供了新的理論依據(jù)。

通過體外實驗，我們認(rèn)為NF-κB、IL-6參與了COPD的炎性反應(yīng)；Gln能明顯抑制COPD患者外周血PBMC中NF-κB、IL-6表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)對COPD具有潛在的治療價值，但其具體的機制仍有待進(jìn)一步更深入的研究。

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Effect of glutamine on NF-κB and IL-6 expression in PBMC of patients with chronic obstructive pulmonary disease

Objective To determine the effects of glutamine on the nuclear factor kappa B(NF-kB)activity and IL-6 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD). Methods PBMCs were collected from COPD patients with acute exacerbation(AECOPD group,n=30),stable COPD patients(SCOPD group,n=30)and 15 health controls.Two COPD groups were further divided into 4 subgroups:blank control and glutamine(Gln) groups with 15 patients in each.The levels of NF-κBp65 and IL-6 gene expression in PBMCs were detected by real-time PCR. Results The expression of NF-κBp65 and IL-6 in blank control subgroups of AECOPD and SCOPD patients was higher than that in control group(P＜0.01).The expression of NF-κBp65 and IL-6 in AECOPD Gln subgroup was still higher than that in control group(P＜0.05),while there was no significant difference between control group and SCOPD Gln subgroup(P＞0.05); Compared with AECOPD and SCOPD blank subgroups,the expression of NF-κBp65 and IL-6 were decreased in AECOPD and SCOPD Gln subgroups(P＜0.05).Conclusion Glutamine can inhibit the activation of NF-κB and down-regulate IL-6 level in PBMCs of patients with chronic obstructive pulmonary disease.

COPD Glutamine PBMC NF-κB IL-6

2012-08-16）

（本文編輯：沈昱平）

杭州市衛(wèi)生局基金項目（2011B009）

310009 杭州，安徽醫(yī)科大學(xué)杭州臨床學(xué)院（杭州市第三人民醫(yī)院）呼吸內(nèi)科

黃美健，E-mail：hmeijian@21cn.com