楊樹中與次生細(xì)胞壁生物合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶研究進(jìn)展

楊少輝， 王潔華， 宋英今， 胡榮峰

(天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 天津 300072)

木材對人類生活具有重要的意義，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。木材不僅為我們提供工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)原材料，還可以在防風(fēng)固沙、凈化空氣、維持生態(tài)系統(tǒng)平衡等方面發(fā)揮重要作用[1]。楊樹具有速生、輪伐期短、成材早、易繁殖、用途廣、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，已經(jīng)成為世界中緯度地區(qū)栽培面積最大的速生豐產(chǎn)林和生態(tài)防護(hù)林樹種。因此，根據(jù)市場需求培育不同用途的楊樹新品種已經(jīng)成為目前產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展的必然趨勢，而利用基因工程手段改良林木材性是加速林木新品種選育的創(chuàng)新手段。隨著楊樹基因組測序計(jì)劃的完成，楊樹中功能基因的克隆和功能基因組學(xué)的研究被大大推進(jìn)。木材主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三種主要成分組成，闡明它們的生物合成機(jī)理是我們理解木材形成過程的第一步?，F(xiàn)階段，纖維素和木質(zhì)素相關(guān)研究較為廣泛，而半纖維素的研究相對很少[2,3]。

在植物體內(nèi)，化合物的糖基化是一種很普遍的生理現(xiàn)象，是植物細(xì)胞維持代謝平衡的主要機(jī)制之一[4]。植物糖基轉(zhuǎn)移酶是專門負(fù)責(zé)催化糖基化反應(yīng)的酶，它將活性糖基從核苷糖，通常是從尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖轉(zhuǎn)移到次級代謝物等一系列化合物受體上[5]。糖基轉(zhuǎn)移酶具有多種功能和生物活性，作用底物廣，同時(shí)糖基化還能產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)，因此糖基轉(zhuǎn)移酶對植物小分子化合物的作用影響著植物生長發(fā)育的眾多方面。研究發(fā)現(xiàn)，糖基轉(zhuǎn)移酶在楊樹木質(zhì)部中參與碳水化合物的合成和重構(gòu)，進(jìn)而直接影響木質(zhì)部的發(fā)育，理解這些糖基轉(zhuǎn)移酶在木材形成過程中的作用機(jī)理將有助于我們理解木材形成的整個(gè)過程，并為將來改良材性奠定基礎(chǔ)[6]。本文針對楊樹中參與次生細(xì)胞壁生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族及其生物學(xué)功能進(jìn)行了綜述，并對其在選育和改良楊樹品種方面的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 糖基轉(zhuǎn)移酶及其家族簡介

糖基轉(zhuǎn)移酶是多基因家族編碼，其數(shù)量幾乎占到古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物體基因產(chǎn)物的1%～2%[7]。通常，糖基轉(zhuǎn)移酶的分類是按照其催化反應(yīng)機(jī)理和反應(yīng)底物的特異性來進(jìn)行的，但是隨著糖基轉(zhuǎn)移酶數(shù)量的急劇增加，人們對其按照序列的同源性重新進(jìn)行了分類[8,9]。目前為止，生物界的糖基轉(zhuǎn)移酶被劃分為92個(gè)家族[10]，其中，糖基轉(zhuǎn)移酶家族1(GT1)，通常指UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)，是植物中最大的糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族。這個(gè)家族中的酶所催化的底物是一些親脂性的小分子化合物，一個(gè)或多個(gè)糖基可以結(jié)合在這些分子的-OH、-COOH、-NH2、-SH或C-C基團(tuán)上[11]。在許多物種間，UGT基因中能夠編碼蛋白的基因占該物種總基因數(shù)比例相似[7]；但是，對于特定的糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族而言，不同物種則占有不同的比例[10]。在擬南芥和水稻中，GT1所占比例分別為>25%和>35%，而GT2、GT8、GT31 和GT47家族所占比例都接近6%～9%之間。在糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族中，GT2、GT8和GT47家族為植物體內(nèi)所特有的，GT29為人類特有，GT11、GT14 和GT92為線蟲特有，GT1和GT31家族為大部分生物體中都共有[10]。

植物糖基轉(zhuǎn)移酶在植物體內(nèi)催化糖苷鍵的形成，從而合成天然寡聚糖[7]。1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是目前研究最為廣泛的、具有生物催化作用的糖基轉(zhuǎn)移酶，并且具有巨大的商業(yè)價(jià)值。隨著許多植物基因組測序的完成，植物糖基轉(zhuǎn)移酶的家族成員不斷增多，許多編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因被列入基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫中。但目前只有少于5%的糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基供體和受體被鑒定出來，因此要深入地了解糖基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[10]。Yonekura-Sakakibara等[10]為了解陸生植物植物糖基轉(zhuǎn)移酶家族1(UGTs)在進(jìn)化中如何在數(shù)量和功能上進(jìn)行擴(kuò)展，篩選了6種模式植物(小立碗蘚、江南卷柏、毛果楊、水稻、擬南芥和琴葉擬南芥)中的UGT蛋白序列，并從中得到了保守區(qū)域。隨著更多植物糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員的結(jié)構(gòu)被破解，加上目前在體外通過生物化學(xué)獲得大量的、與植物糖基轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)的數(shù)據(jù)，我們有可能預(yù)測多基因家族中每個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)一步了解每種糖基轉(zhuǎn)移酶與底物相互識別和作用的機(jī)制。

2 楊樹中與次生細(xì)胞壁生物合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族

通過對楊樹木質(zhì)部基因轉(zhuǎn)錄圖譜進(jìn)行分析，已經(jīng)鑒定出25個(gè)與木材形成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶，它們分別屬于GT2、GT8、GT14、GT31、GT43、GT47和GT61基因家族[12，13]。其中GT47C、GT8D、GT8E/F、GT43A/B在擬南芥中可以找到同源基因[12]。

楊樹GT2家族包括40個(gè)成員，其中包含楊樹EST文庫中的9個(gè)纖維素合成酶[13]。微矩陣和實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明，楊樹纖維素合成酶基因(PttCesA1，PttCesA3-1，PttCesA3v-2， PttCesA9)在木質(zhì)部的形成中具有高表達(dá)[13,14]，但其具體的作用機(jī)制并不明確。GT2還包含一個(gè)類纖維素酶基因(PttGT2A)，它在楊樹形成層組織中高效表達(dá)，可能參與纖維素-多糖的合成。AtCSL9A是與PttGT2A同源性最高的擬南芥纖維素酶基因，通過T-DNA插入突變分析，它是一種甘露醇糖合成酶，由此推斷，PttGT2A可能作為甘露醇糖合成酶或木聚糖合成酶參與楊樹次生木質(zhì)部的合成[1]。

GT8基因家族在楊樹表達(dá)文庫中找到13個(gè)基因[1]。其中GT8D和GT8E/F與擬南芥中的IRX8和PARVUS分別為同源基因，它們在葡糖醛木聚糖含量高的木纖維和維管組織具有特異和高效的表達(dá)，突變這些基因后導(dǎo)致葡糖醛木聚糖的含量下降，葡糖醛木聚糖的還原末端的四糖幾乎完全消失，表明這兩個(gè)基因可能參與葡糖醛木聚糖的還原末端四糖的生物合成過程[12,15-18]。PttGT8A在楊樹木質(zhì)部也具有高表達(dá)；PttGT8B和PttGT8C屬于次生細(xì)胞壁中合成特異纖維素酶的基因家族；PttGT8G可能參與果膠的合成[22]，但其催化反應(yīng)的供體和受體仍不明確[1]。

GT14家族和GT31家族各有兩個(gè)成員，分別是PttGT14A和PttGT14B及PttGT31A和PttGT31B。GT14家族的分類和酶特異性目前仍未知。GT31家族在次生細(xì)胞壁的行程中高效表達(dá)，由多個(gè)不同亞家族組成，可能與該家族成員具有多種供體/受體的特異性相關(guān)[1]。

GT43家族包含序列非常相似的PttGT43A和PttGT43B。在irx9擬南芥突變體中過量表達(dá)PttGT43B可以恢復(fù)缺陷植株的表型，其中包括恢復(fù)次生細(xì)胞壁的厚度以及木糖的含量[20,21]。GT47家族中，PttGT47A-PttGT47D在木質(zhì)部具有高表達(dá)，PttGT47B和PttGT47C到目前還沒有相關(guān)的功能鑒定，但由于它們在木質(zhì)部有高表達(dá)，猜測它們有可能參與木質(zhì)部的生理活動。GT61家族中，在楊樹ESTs文庫中只找到一個(gè)候選基因PttGT61A，但其具體作用機(jī)理目前仍不清楚[22,23]。

3 楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶參與次生細(xì)胞壁的生物合成

通過對楊樹不同組織部位進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄圖譜分析，并通過生物信息學(xué)手段分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)楊樹中若干糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員會參與葡糖木聚糖(GX)和纖維素的合成[24]。

3.1 參與葡糖木聚糖(GX)的生物合成

在與木材合成相關(guān)的楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶中，GT47C、GT8D、GT8E/F在擬南芥中的同源基因分別是FRA8/F8H、IRX8 和PARVUS，這些基因都在葡糖木聚糖含量較高的纖維和維管中具有特異性的表達(dá)[15-18]。通過基因突變、過量表達(dá)以及突變互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些糖基轉(zhuǎn)移酶家族對葡糖木聚糖含量和葡糖木聚糖還原端的四糖合成起關(guān)鍵性作用[15-17,20]。將楊樹GT基因在相關(guān)的擬南芥突變體中進(jìn)行功能互補(bǔ)分析表明，這些參與葡糖木聚糖合成的GT基因在草本植物和木本植物中功能保守[23,24]，因此對木材中葡糖木聚糖的遺傳修飾可能為生物能源中難以降解的纖維素高效轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟翘峁┝艘粭l新思路[24]。Lee等人利用RNA干擾技術(shù)(RNAi)抑制PoGT47C在楊樹中的表達(dá)，使楊樹木材的葡糖木聚糖和纖維素含量明顯下降，纖維和維管厚度顯著降低，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)纖維素降解度有所提高[25]。Nishikubo等人通過過量表達(dá)楊樹木糖葡聚糖內(nèi)源糖基轉(zhuǎn)移酶(XETs)PtxtXET16-34來驗(yàn)證其在木材發(fā)育中的功能。結(jié)果表明，所有XETs的編碼基因都在木質(zhì)部發(fā)育中有所表達(dá)，其中有5個(gè)基因的表達(dá)較高而且廣泛，PtxtXET16-34具有特異性表達(dá)，它們的轉(zhuǎn)基因植株中細(xì)胞壁的木糖葡聚糖發(fā)生了改變，但其效果取決于植株的發(fā)育時(shí)期。由于PtxtXET16-34的過量表達(dá)會促進(jìn)導(dǎo)管發(fā)育而不是纖維的延伸，它們可能在某種程度上決定著細(xì)胞壁的致密與疏松程度[26]。

3.2 參與纖維素的生物合成過程

纖維素微纖維通過定位在質(zhì)膜上的玫瑰花結(jié)狀復(fù)合物合成，該復(fù)合物可能由3個(gè)不同的纖維素酶蛋白(GT2)、SUS(GT4)和其他未經(jīng)鑒定的蛋白組成的[27]，因而，研究與其相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)和功能，將有助于揭示纖維素微原纖維合成的機(jī)理。通過對特定組織進(jìn)行基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)等分析，發(fā)現(xiàn)楊樹的合成纖維素酶基因(PttCesA1、PttCesA3-1、PttCesA3-2、PttCesA9)屬糖基轉(zhuǎn)移酶家族，這些基因在白楊木質(zhì)部形成過程中為高表達(dá)[13,14]。在楊樹、水稻、大麥和擬南芥中與次生細(xì)胞壁相關(guān)的纖維素酶基因也相繼被鑒定出來[1]，但其具體作用機(jī)制還不明確。

4 展望

生物界的糖基轉(zhuǎn)移酶共包括92個(gè)家族，在許多物種中，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因在總基因數(shù)中的比例相似[28]；但是，在不同糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族中的比例不同[10]。隨著更多物種全基因組測序的完成，與次生細(xì)胞壁生物合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員會迅速得到挖掘和鑒定擴(kuò)展，同時(shí)還需要實(shí)驗(yàn)去證實(shí)它們的生物學(xué)功能。本文對楊樹中7個(gè)與次生細(xì)胞壁形成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶家族的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了介紹，這些GT家族的大多數(shù)成員已經(jīng)被挖掘出來，而且它們的擬南芥同源基因的功能也得到了鑒定，但是，在木本植物中，對這些GTs的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的研究還比較少，還需要更多的相關(guān)研究來闡明其生理功能和作用機(jī)理。

隨著人口的膨脹，環(huán)境的惡化，導(dǎo)致了能源和環(huán)境的危機(jī)。木材是人類最古老的可再生能源，也是紡織、紙漿、造紙以及其它產(chǎn)品的原材料。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，利用植物纖維來獲得新型產(chǎn)品的可能性被大大拓展，木材原材料的結(jié)構(gòu)、成分和性質(zhì)均可以通過生物工程的方法加以改變。楊樹是重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)林木，具有諸多優(yōu)點(diǎn)，對解決木材短缺起著很大作用。隨著楊樹的全基因組測序的完成，與次生細(xì)胞壁生物合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族成員會迅速得到分離與鑒定，這必將為楊樹育種者提供更多的選擇和思路。

[1]Aspeborg H,Schrader J,Coutinho P M,et al. Carbohydrate-active enzymes involved in the secondary cell wall biogenesis in hybrid aspen [J]. Plant Physiol,2005,137: 983-997.

[2]Boerjan W,Ralph J. Baucher M. Lignin biosynthesis [J]. Annu Rev Plant Biol,2003,54: 519-546.

[3]Joshi C P,Bhandari S,Ranjan P,et al. Genomics of cellulose biosynthesis in poplars [J]. New Phytol,2004,164: 53-61.

[4]Weis M,Lim E K,Bruce N C,et al. Engineering and kinetic characterisation of two glucosyltransferases fromArabidopsisthaliana[J].Biochimie,2008,90: 830-834.

[5]Lim E K,Bowles D J. A class of plant glycosyltransferases involved in cellular homeostasis [J]. EMBO J,2004,23: 2915-2922.

[6]Ye Z H,York W S,Darvill A G. Important new players in secondary wall synthesis [J]. Trends in Plant Science,2006,11(4): 162-164.

[7]Lairson L L,Henrissat B,Davies G J,et al. Glycosyltransferases: structures,functions and mechanisms [J]. Annu Rev Biochem,2008,77: 521-555.

[8]Campbell J A,Davies G J,Bulone V,et al. A classification of nucleotide-diphospho-sugar glycosyltransferases based on amino acid sequence similarities [J]. Biochem J,1997,326: 929-939.

[9]Coutinho P M,Deleury E,Davies G J,et al. An evolving hierarchical family classification for glycosyltransferases [J]. J Mol Biol,2003,328:307-317.

[10]Yonekura-Sakakibara K,Hanada K. An evolutionary view of functional diversity in family 1 glycosyltransferases [J].The Plant Journal,2011,66:182-193.

[11]Bowles D,Isayenkova J,Lim E K,et al. Glycosyltransferases: managers of small molecules [J].Curr Opin Plant Biol,2005,8: 254-263.

[12]Lee C,Teng Q,Huang W L,et al. Down-regulation of PoGT47C expression in poplar results in a reduced glucuronoxylan content and an increased wood digestibility by cellulose [J].Plant Cell Physiol,2009,50(6): 1075-1089.

[13]Djerbi S,Aspeborg H,Nilsson P,et al. Identification and expression analysis of genes encoding putative cellulose synthases (CesA) in the hybrid aspen,Populustremula(L.) xP.tremuloides(Michx.) [J]. Cellulose,2004,11: 301-312.

[14]Hertzberg M,Aspeborg H,Schrader J,et al. A transcriptional roadmap to wood formation [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98: 14732-14737.

[15]Zhong R,Pena M J,Zhou G K,et al.Arabidopsisfragile Fiber8,which encodes a putative glucuronyltransferase,is essential for normal secondary wall synthesis [J].Plant Cell,2005,17: 3390-3408.

[16]Lee C,Zhong R,Richardson E A,et al. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis [J]. Plant Cell Physiol,2007,48: 1659-1672.

[17]Pena M J,Zhong R,Zhou G K,et al.Arabidopsisirregular xylem8 and irregular xylem9: implications for the complexity of glucuronoxylan biosynthesis [J]. Plant Cell,2007,19: 549-563.

[18]Persson S,Caffall K H,Freshour G,et al. TheArabidopsisirregular xylem8 mutant is deficient in glucuronoxylan and homogalacturonan,which are essential for secondary cell wall integrity [J]. Plant Cell,2007,19: 237-255.

[19]Bouton S,Leboeuf E,Mouille G,et al. Quasimodo1 encodes a putative membrane-bound glycosyltransferase required for normal pectin synthesis and cell adhesion inArabidopsis[J]. Plant Cell,2002,14: 2577-2590.

[20]Zhou G K,Zhong R,Richardson E A,et al. The poplar glycosyltransferase GT47C is functionally conserved withArabidopsisfragile Fiber8 [J]. Plant Cell Physiol,2006,47: 1229-1240.

[21]Zhou G K,Zhong R,Richardson E A,et al. Molecular characterization of PoGT8D and PoGT43B,two secondary wall-associated glycosyltransferases in poplar [J].Plant Cell Physiol,2007,48: 689-699.

[22]Lukowitz W,Nickle T C,Meinke D W,et al.Arabidopsiscyt1 mutants are deficient in a mannose-1-phosphate guanylyltransferase and point to a requirement of N-linked glycosylation for cellulose biosynthesis [J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98: 2262-2267.

[23]Williamson R E,Burn J E,Hocart C H. Towards the mechanism of cellulose synthesis [J]. Trends Plant Sci,2002,7:461-467.

[24]Himmel M E,Ding S Y,Johnson D K,et al. Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production [J]. Science,2007,315: 804-807.

[25]Lee C,Teng Q,Huang W L,et al. Down-regulation of PoGT47C expression in poplar results in a reduced glucuronoxylan content and an increased wood digestibility by cellulase [J]. Plant Cell Physiol,2009,50,1075-1089.

[26]Nishikubo N,Takahashi J,Roos A A,et al. Xyloglucan endo-transglycosylase-mediated xyloglucan rearrangements in developing wood of hybrid aspen [J]. Plant Physiol,2011,155(1): 399-413.

[27]Doblin M S,Kurek I,Jacob-Wilk D,et al. Cellulose biosynthesis in plants: from genes to rosettes[J]. Plant Cell Physiol,2002,43: 1407-1420.

[28]Lairson L L,Henrissat B,Davies G J,et al. Glycosyltransferases: structures,functions and mechanisms [J]. Annu Rev Biochem,2008,77: 521-555.