MicroRNA研究的基本方法及流程

張韶輝 魏廣和 綜述 劉立新 審校

（濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院山東省心臟疾病診療重點實驗室，山東濟寧272029）

MicroRNA（miRNA）屬于非編碼RNA大家族，是廣泛存在于真核生物細胞中、長約21～25個堿基的單鏈小分子RNA。1993年在線蟲中發(fā)現(xiàn)第一個miRNA（lin－4），2001年《Science》報道了分別從線蟲、果蠅和人體內(nèi)找到的幾十個類似lin－4的小RNA，并命名為miRNA[1]，此后對miRNA的研究才取得了飛速發(fā)展。miRBase（http：／／www.mirbase.org／）的最新數(shù)據(jù)顯示，截至目前已有18226種miRNA被發(fā)現(xiàn)，其中人類有1527種miRNA被鑒定出來。miRNA開辟了生物學(xué)研究的一個新領(lǐng)域，目前的研究方法多種多樣，相關(guān)文獻也有不少，但大多僅對某一側(cè)面展開，鑒于以上情況，我們認為有必要將miRNA的研究概況作一相對簡單而完整的闡述，希望對初涉入該領(lǐng)域的同道有所幫助。

1 miRNA的形成和作用機制

miRNA有高度保守的基因序列，具備廣泛的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)功能，其調(diào)控方式是導(dǎo)致靶mRNA的降解或抑制靶基因翻譯（圖1）。

絕大多數(shù)miRNA基因在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄生成長的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，稱為初級miRNA（primary－miRNA，pri－miRNA）。pri－miRNA一般具有帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴。pri－miRNA隨后被由RNA酶Ⅲ核酸內(nèi)切酶Drosha－DGCR8復(fù)合體剪切，產(chǎn)生約70個核苷酸的發(fā)夾狀RNA，稱為前體miRNA（precursor－miRNA，pre－miRNA）。pre－miRNA在Exprotin－5復(fù)合物的作用下轉(zhuǎn)運出細胞核，并在胞漿中由Dicer酶剪切成為miRNA雙鏈結(jié)構(gòu)，在解螺旋酶的作用下分離。其中一條鏈miRNA被降解，剩下的另一條鏈即為成熟miRNA，成熟miRNA與Argonaute蛋白以及Dicer結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA－induced silencing complex，RISC），因此miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用是以RISC復(fù)合物的形式進行的。

miRNA通過與靶mRNA的3′－非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR）堿基配對結(jié)合，然后對靶mRNA進行切割或者翻譯抑制。至于是抑制還是切割則取決于miRNA與靶序列互補的程度。如果miRNA與靶mRNA匹配完全，則RISC復(fù)合體降解靶mRNA；若兩者序列部分匹配，尤其是miRNA的5'端2～8個被稱為種子序列（seed sequence）的核苷酸與靶mRNA匹配完好，則通過抑制靶mRNA的翻譯來沉默特定基因。在植物中，miRNA主要通過降解mRNA發(fā)揮沉默功能[2]。在動物中，多數(shù)miRNA是通過抑制翻譯發(fā)揮功能[3]。

2 miRNA的研究策略

據(jù)估計，miRNA能夠調(diào)控人類基因組約1／3的基因，它通過調(diào)控靶基因的表達參與了生命過程中的發(fā)育、細胞增殖、凋亡、造血、器官形成等一系列重要進程，與心臟病、糖尿病、癌癥、艾滋病等多種疾病密切相關(guān)[4]。毫無疑問，針對miRNA的研究已成為一大熱點，但miRNA分子序列短小，存在較多的互補序列，在不同生物體內(nèi)與靶基因結(jié)合的方式也不盡相同，而且常與多種蛋白相互作用，這使得建立一個有效而且普遍適用的研究方法非常困難。目前檢測miRNA的常用方法包括Northern blotting、原位雜交、RT－PCR、miRNA芯片等，而通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA及其靶基因，并進一步研究其表達與功能逐漸成為研究的熱點。

2.1 miRNA的分離

目前分離RNA有兩大類主流方法：1）玻璃纖維濾膜／硅膠濾膜法；2）基于苯酚的抽提法（TRIzol法）。目前各大試劑公司均有專門的miRNA提取試劑盒可供選擇。miRNA的檢測方法較多，但應(yīng)注意在檢測之前，一般應(yīng)當對獲得的RNA進行質(zhì)量控制，比如用紫外分光光度計及凝膠電泳檢測miRNA的產(chǎn)量及純度。

圖1 miRNA的作用機制及研究流程

2.2 miRNA檢測方法

對循環(huán)miRNA進行量化檢測就需要加入一個內(nèi)參使檢測結(jié)果標準化，試劑盒中提供的內(nèi)參通常是秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）miRNA，這種miRNA不存在于人類及嚙齒類動物，可以加到提取總RNA的每個標本中。雖然仔細選擇合適的引物和內(nèi)參是獲得理想結(jié)果所必須的，但是某些miRNA家族成員之間由于高度的序列同源性，交叉反應(yīng)有時仍難以避免[5]。

2.2.1 基因克隆 大多數(shù)現(xiàn)有的miRNA是通過反轉(zhuǎn)錄DNA（cDNA）克隆識別和鑒定出來的，這是發(fā)現(xiàn)miRNA的重要方法[6]。直接克隆的方法通常是從總RNA中提取大約22nt的小RNA分子，制備一個小RNA的cDNA文庫。將文庫中的小RNA序列與基因組數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，排除非miRNA序列后，通過Northern blotting得到最終確認?；蚩寺》椒ǖ膬?yōu)點是對于高豐度、常表達的基因可以獲得完整的miRNA序列，缺點是對于生物體內(nèi)濃度很低（表達量低或表達產(chǎn)物極不穩(wěn)定等）或者某些只在生物體的特定時期、特定組織器官中表達的miRNA，直接克隆法則無法獲取。

2.2.2 Northern blotting Northern blotting是最為經(jīng)典的RNA檢測方法，也是現(xiàn)在檢測miRNA表達的最主要手段。目前所有克隆和生物信息學(xué)分析得來的miRNA都需要經(jīng)過Northern blotting來驗證和確認。Northern blotting缺點是費時以及消耗大量的標本，可測范圍小，存在一定的錯配雜交等問題，因此Northern blotting靈敏度較低且不適合進行高通量的檢測，在miRNA檢測時，Northern blotting通常用于結(jié)果的驗證。

2.2.3 原位雜交（in situ hybridization，ISH）ISH是了解miRNA時間和組織特異性表達最常用的方法。但由于miRNA分子太小，傳統(tǒng)ISH技術(shù)需進一步改進，以增加雜交親和性，從而避免miRNA在雜交及隨后的洗脫過程中丟失。現(xiàn)在，一種新的雜交探針—鎖定核苷酸探針（locked nucleic acid，LNA）可克服上述困難，這種修飾后的寡核苷酸探針與互補的RNA結(jié)合后具有很好的雙鏈穩(wěn)定性。這種技術(shù)又稱為鎖定核苷酸原位雜交（LNA－ISH），大大提升了其靈敏度和有效性[7]。目前Northern blotting和ISH已經(jīng)廣泛用于細胞或組織中單個pre－miRNA或miRNA的檢測。

2.2.4 實時PCR（Real time PCR，RT－PCR）RT－PCR能檢測miRNA的表達量，尤其是在使用Taqman探針法時特異性高。RT－PCR也可用來檢測pre－miRNA的表達水平?；赑CR技術(shù)檢測miRNA的方法尚有引物延伸法，就是在引物的5’末端加一個特異標記，可以定量測定較低濃度的miRNA含量。RT－PCR可以較精確地定量檢測miRNA水平，也經(jīng)常用于驗證軟件預(yù)測的miRNA。該方法具有高靈敏度、高特異性、樣品需量低（可檢測到總量低至納克級的樣品）及測量范圍寬等優(yōu)點，缺點是價格較高。

2.2.5 miRNA基因芯片 基因芯片（microarray）是一種更快、更廣泛、更有前途的檢測miRNA的方法，可以高質(zhì)量地鑒定多數(shù)已知miRNA的表達。由于miRNA片段小，而且miRNA分子間的差別有可能只是一個堿基，所以對芯片要求極高。芯片檢測的前提是首先分離得到具有高質(zhì)量的、一定濃度的小RNA組分。為了達到這一目的，通常需要用專門的miRNA提取盒抽提，因為一般的抽提方法會丟失200nt以下的小RNA。雖然芯片技術(shù)以其高通量及并行處理的特點在基因信息分析中占據(jù)重要地位，但信息量大并不等于質(zhì)量高。基因芯片技術(shù)一般多用于miRNA的初篩，得到的結(jié)果通常需經(jīng)過Northern blotting和RT－PCR的驗證，其優(yōu)點是高產(chǎn)出、高靈敏度、高特異性，但缺點在于價格昂貴、結(jié)果可重復(fù)性差，更大的缺陷在于基因芯片需要根據(jù)已知miRNA的序列信息來進行設(shè)計，因此難以檢測目前未知的miRNA。

2.2.6 深度測序（deep sequencing） 深度測序是對傳統(tǒng)測序技術(shù)的一次革命性改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，因此又被稱為高通量測序。深度測序用于對小RNA序列的分析比基因芯片更加敏感。深度測序不依賴于提前預(yù)知序列信息，能輕易地解決基因芯片在檢測小分子時遇到的技術(shù)難題（短序列，高度同源），因此深度測序能夠在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。但深度測序的缺點在于其產(chǎn)生的大量復(fù)雜原始數(shù)據(jù)，這需要相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù)來解釋，而且深度測序花費巨大，尚難廣泛使用。這項技術(shù)只是在近來的少數(shù)研究中有用到，它成功地檢測到了基因芯片未發(fā)現(xiàn)的miRNA[8]。

用高通量的分子生物學(xué)工具（如miRNA芯片、深度測序）對全基因組進行miRNA表達的檢測，可以獲得大量在各種病理生理條件下的miRNA信息，這或許是研究miRNA的一個捷徑。標本可以是從體液、血漿、組織細胞中提取的總RNA，但由于miRNA只占總RNA的0.01%，因此通常要對miRNA進行純化或富集以提高其檢測的靈敏度。雖然高通量篩選可短時間獲得大量的數(shù)據(jù)，但必須注意高通量檢測結(jié)果需要通過Northern blotting、RT－PCR或ISH來進行驗證。

2.3 miRNA數(shù)據(jù)庫及靶標預(yù)測工具

miRNA對靶基因的調(diào)節(jié)并非是一對一的，一個miRNA分子可同時作用于多個靶基因，而一個基因也可同時被多個miRNA分子調(diào)節(jié)，因此miRNA對于基因的調(diào)節(jié)存在著多種組合模式。雖然上述生物實驗的結(jié)果可靠性高，但是其周期長、代價高，并且由于miRNA自身的一些限制（如序列較短，組織特異性和時序性等），使miRNA靶標很難全部通過傳統(tǒng)的實驗方法得到驗證。而事實上，迄今為止只有少數(shù)的miRNA靶標被生物實驗證實。精確鑒定miRNA所調(diào)節(jié)的靶標是目前的挑戰(zhàn)。但目前研究發(fā)現(xiàn)miRNA和靶基因的相互作用具有一定的規(guī)律性，可以允許編程來進行預(yù)測，通過建立計算模型，整合已有的生物學(xué)數(shù)據(jù)來挖掘疾病相關(guān)的miRNA具有周期短、代價低的特點。

通過對已知靶基因的miRNA進行分析，目前已經(jīng)出現(xiàn)了多種軟件及數(shù)據(jù)庫用于miRNA的檢索和靶標預(yù)測（表1），如miRBase[9]、miRGator[10]和miRGen[11]主要針對miRNA注釋和系統(tǒng)命名；TarBase[12]收集了實驗證實的或計算預(yù)測miRNA與靶基因的關(guān)系。所有這些數(shù)據(jù)庫通過收集、存儲、管理這些數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了在線數(shù)據(jù)共享，方便了獲取這些miRNA的信息。從2003年第一個靶基因預(yù)測軟件miRanda到現(xiàn)在，已經(jīng)涌現(xiàn)出數(shù)十個靶基因預(yù)測軟件，如TargetScan、PicTar、PITA、mi－Randa、DIANA－MicroT、RNA22等[13]。Tar－getScan、PicTar、miRanda是基于堿基互補性及保守性，PITA和RNA22是基于靶區(qū)可接性和模式識別。

表1 常用的miRNA數(shù)據(jù)庫及靶標預(yù)測工具

預(yù)測軟件的發(fā)展需要實驗技術(shù)的發(fā)展，只有實驗驗證的miRNA靶基因增多，miRNA和靶基因作用機制的逐漸闡明，預(yù)測算法引入更多作用參數(shù)，才能使預(yù)測軟件進一步完善。預(yù)測軟件的進一步完善也有助于實驗室實驗，使科學(xué)家更有針對性地對感興趣的miRNA靶基因進行研究。值得注意的是，miRNA靶基因預(yù)測軟件往往對已知的miRNA靶基因有很高的預(yù)測特異性和敏感性，而對于未知的靶基因預(yù)測，各預(yù)測軟件之間交集很小，假陽性率也較高。顯然，聯(lián)合數(shù)個預(yù)測軟件的結(jié)果（或者基因芯片的結(jié)果）并取其交集，預(yù)測結(jié)果將更加全面及準確[14]。

2.4 靶標驗證工具

由于miRNA—靶標之間關(guān)系的復(fù)雜性和預(yù)測軟件的局限性，軟件篩選得到的結(jié)果必須進行生物實驗驗證。

2.4.1 UTR分析（UTR analysis） 用于鑒定miRNA靶位點的最常用方法就是熒光指示測定法，將靶mRNA的3’UTR克隆到熒光素酶報告載體上。熒光酶能夠顯示miRNA是否結(jié)合到這個UTR上，并提示在mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平調(diào)控基因的表達。

2.4.2 miRNA類似物（mimics）和抑制物（inhibitors） 另一種間接的方法是用miRNA的類似物和抑制物[15]。導(dǎo)入化學(xué)合成的mimics或inhibitors，通過RT－PCR或免疫印跡（Western blotting）檢測miRNA的靶標產(chǎn)物。其他方法還有轉(zhuǎn)錄組分析（transcriptome analysis）、下拉檢測（pull down assays）、蛋白質(zhì)組分析（proteome analysis）等[16]。

2.5 miRNA的調(diào)控功能研究

基因功能的研究通常采用過表達或干涉（抑制、敲除）的方法，miRNA的研究也不例外。通過導(dǎo)入化學(xué)合成的mimics或inhibitors，觀察靶mRNA及編碼蛋白表達以及細胞、動物水平的表型變化，進行信號通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。

2.5.1 體外研究（細胞培養(yǎng)） mimics和inhibi－tors用于細胞培養(yǎng)的研究，可以明確miRNA的調(diào)控作用和生理效應(yīng)，如細胞增殖、死亡、分化、遷移、毒性和形態(tài)變化。mimics是雙鏈的寡核苷酸，能夠增強miRNA的作用，它將進一步降低靶蛋白的水平；而inhibitors是單鏈寡核苷酸，能夠與靶mRNA競爭miRNA，從而抑制miRNA發(fā)揮作用，導(dǎo)致蛋白水平增加。但在將mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染細胞之前還有許多細節(jié)需要綜合考慮[17]，在此不詳述。

2.5.2 體內(nèi)研究（動物實驗） 由于通過mimics增加miRNA水平的方法尚未在動物實驗中建立[18]，這里主要對inhibitors的體內(nèi)實驗進行闡述。miRNA的inhibitors也稱為antimiRs，是一種部分或完全與miRNA互補的反義寡核苷酸鏈，antimiRs可以降低致病miRNA的水平，從而增加靶mRNA或靶蛋白的水平。目前文獻報道較多的antimiRs化學(xué)修飾方法有兩類：

1）2－氧甲基miRNA（2'－O－methyl miRNA）也稱為antagomir，它能夠連接到膽固醇上，因此能克服體內(nèi)細胞膜、組織等障礙富集于靶細胞。通過與體內(nèi)的成熟miRNA競爭性結(jié)合，阻止miRNA與其靶mRNA的互補配對，抑制miRNA發(fā)揮作用。antagomir在動物實驗中可用全身或局部注射、吸入、喂藥等方法進行給藥，作用效果持續(xù)時間可長達數(shù)周。其缺點是用藥劑量較大，某些情況需要反復(fù)給藥[19]。

2）鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）修飾LNA是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物，由于LNA與DNA／RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架，故其對DNA／RNA有很好的識別能力和強大的親和力，與其他寡核苷酸類似物相比，LNA具有與DNA／RNA強大的雜交親和力、反義活性和抗核酸酶能力，并有合成簡單、水溶性好、體內(nèi)無毒性等特點。LNA對miRNA的抑制作用更持久，甚至可達60d以上。這些特點使LNA只需要相對低的劑量、通過靜脈或皮下用藥就可以對miRNA達到滿意的抑制效果[20]。體內(nèi)抑制miRNA的其它方法還有miRNA面紗（mask）、miRNA橡皮擦（eraser）、miRNA海綿（sponge）等[21]，因為還沒有得到廣泛的應(yīng)用，在此不作詳述。

2.6 miRNA臨床應(yīng)用研究

對miRNA的臨床應(yīng)用研究目前主要集中于兩個方面：1）體液miRNA的檢測及其與疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性的研究，以期篩選到更為敏感的生物標志物，為疾病診斷、疾病分型和預(yù)后提供幫助；2）對miRNA信號路徑的研究，以尋找并篩選潛在的藥物靶點，開辟基于miRNA的分子靶向治療及個體化治療方案。

2.6.1 miRNA作為生物標志物的研究 選擇miRNA作為生物標記物是基于以下的特點：1）miRNA在人的體液（包括血液、唾液、尿液、胸腹水等）中廣泛存在，體液中miRNA表達譜在病理狀態(tài)下會發(fā)生特征改變；2）體液和組織中的miRNA因常與蛋白質(zhì)等構(gòu)成復(fù)合物，具有較強的抗RNA酶（RNase）降解能力；3）miRNA表達具有組織特異性和時序性，部分miRNA分子只表達在特定的體液或組織中，如miR－1是心臟和肌肉特異性miRNA[22]，有些miRNA僅在發(fā)育的特定時段表達，但在某疾病狀態(tài)下可被重新激活而表達，如正常miR－21和miR－320僅在胎兒時期表達，但在心力衰竭時其表達量甚至超過了胎兒期[23]；4）血液miRNA可長期保存，即使放置室溫一周或反復(fù)凍融，miRNA僅有微量的改變[24]，在各種極端條件下（如煮沸、強酸或強堿等）miRNA含量也無明顯改變。因此體液含量豐富而穩(wěn)定的miRNA，較之成分復(fù)雜、易降解、易變性的蛋白分子，可能更適合作為生物標志物應(yīng)用于臨床。但是，體液miRNA作為生物標志物的研究只是剛剛起步，目前研究的病種還不全面，所檢測的病例數(shù)也有限，miRNA的檢測方法臨床上尚無統(tǒng)一公認的標準，還有待進一步的改善和優(yōu)化[25]。

2.6.2 基于miRNA的靶向治療 由于一個miRNA分子可同時作用于多個靶基因甚至影響整個基因網(wǎng)絡(luò)，人們設(shè)想通過合成inhibitor實現(xiàn)對特定miRNA進行抑制，并達到對疾病靶向治療的目的。與傳統(tǒng)的藥物治療相比，miRNA可以被有效地靶向抑制而不附帶副作用[26]，如Park等[27]通過使用miR－221的反義寡核苷酸，選擇性地阻斷了人體肝癌移植到小鼠體內(nèi)miR－221的作用，結(jié)果顯著延長了實驗動物的生存時間，并增強了相關(guān)抑癌基因的活性。Obad S等[28]宣稱成功地研發(fā)了一類基于LNA的化合物，這類化合物具有極高的親和力和靶向特異性，可抑制大量的單個miRNA，甚至全部的miRNA家族而不會發(fā)生脫靶效應(yīng)。這為疾病的治療提出了新的模式，從而為心血管疾病、代謝疾病、炎癥疾病和癌癥等疾病的治療提供了一條新的有潛力的途徑。

3 小結(jié)

必須提到的是，本文所述的miRNA研究流程只是對現(xiàn)階段在該領(lǐng)域一個相對常見的研究策略和方法的粗略總結(jié)。因為還有許許多多的研究方法，在此限于知識有限及篇幅而不能詳細闡述。隨著miRNA研究的全面深入，相信將來會有更多、更有效的研究方法涌現(xiàn)出來，必將全面更新目前的研究策略。雖然miRNA已經(jīng)在疾病靶向領(lǐng)域展現(xiàn)了其巨大的潛力，但要在浩瀚的基因組中尋找每一個可能的miRNA基因，鑒定其信號傳導(dǎo)途徑和生物學(xué)意義，這將是一個巨大的挑戰(zhàn)，需要將生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)以及遺傳學(xué)等多個學(xué)科的研究方法結(jié)合起來才能解決。miRNA的研究既需要從傳統(tǒng)的實驗方法中獲得幫助，又迫切需要新技術(shù)新方法的出現(xiàn)。有理由相信，基于miRNA的研究必將全面更新人們對疾病的認識，基于miRNA的分子靶向治療必將全面改變?nèi)藗儗辜膊〉姆绞健?/p>

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