VEGF CD44v6MMP－9在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達(dá)及臨床意義

姚紅梅 郭 靜 石秀玲

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272029）

子 宮 內(nèi)膜異位 癥（endometriosis、EMS）是1885年由VonreckLinghausen［1］首次提出并命名，是一種常見的婦科良性病變，但具有類似于惡性腫瘤的組織侵襲、血管生成等生物學(xué)行為，復(fù)發(fā)率高。以卵巢子宮內(nèi)膜異位癥最多見。其發(fā)病率約為6%～8%，在不孕、痛經(jīng)等患者中，其發(fā)病率有所增加，約為30%～45%。近年來EMS有上升的趨勢，嚴(yán)重影響了婦女的日常生活。關(guān)于EMS發(fā)病機(jī)制的研究被廣泛關(guān)注，為阻斷EMS的發(fā)生、發(fā)展提供新的有效的治療靶點(diǎn)。本研究通過檢測子宮內(nèi)膜異位癥組織中VEGF、CD44v6及MMP－9的表達(dá)，從而探討其在EMS發(fā)病機(jī)制中可能的作用及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2009年3月至2010年10月因卵巢囊腫行腹腔鏡或開腹手術(shù)的患者，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥60例作為研究組。在位內(nèi)膜為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者同時(shí)診刮或切除子宮所得的內(nèi)膜52例。選擇同期在本院因子宮平滑肌瘤行子宮全切，且經(jīng)病理證實(shí)無子宮內(nèi)膜疾病及異位癥患者的子宮內(nèi)膜標(biāo)本44例為對照組。所有患者年齡均35～46歲，均為增殖期子宮內(nèi)膜，月經(jīng)周期規(guī)律，術(shù)前3個(gè)月未應(yīng)用激素治療。各組間的年齡差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 主要試劑

兔抗人VEGF、鼠抗人CD44v6及鼠抗人MMP－9單克隆抗體均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶（SP）免疫組化試劑盒、DAB染色試劑等，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

將蠟塊標(biāo)本進(jìn)行5μm厚連續(xù)切片4張，1張用于HE染色復(fù)查，確定診斷。余者切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。采用SP法行CD44v6、VEGF和MMP－9檢測。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。以0.01mol／L PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性標(biāo)本為陽性對照。

結(jié)果判定：陽性均為棕黃色顆粒，分布于細(xì)胞膜和／或胞漿。具體如下：著色強(qiáng)度：不顯色或顯色不清為0；淺黃色為1；棕黃色為2；深褐色為3。陽性細(xì)胞百分率：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜5%，0分；5%～35%，1分；36%～65%，2分；＞66%，3分。兩項(xiàng)得分相加，0～1分為（－），2～3分為（＋），4分及以上為（?）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SSPS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為0.05，兩分類變量的關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF的表達(dá)

VEGF主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿，灶性分布，在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)，但在上皮細(xì)胞的表達(dá)最強(qiáng)。陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色或棕褐色。3種子宮內(nèi)膜中VEGF表達(dá)的分布差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。進(jìn)一步兩兩比較，卵巢異位內(nèi)膜VEGF的陽性表達(dá)明顯高于在位內(nèi)膜（Z＝－5.725，P＝0.000）與正常內(nèi)膜（Z＝－3.498，P＝0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜中的陽性表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－2.674，P＝0.000）。

表1 3種子宮內(nèi)膜中VEGF表達(dá)的等級比較

2.2 CD44v6的表達(dá)

CD44v6主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、腔面上皮細(xì)胞。主要是細(xì)胞膜陽性，染成棕黃色。胞漿可有少量表達(dá)，但著色比胞膜淺，意義不明確。3種子宮內(nèi)膜中CD44v6表達(dá)的分布差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。進(jìn)一步兩兩比較，卵巢異位內(nèi)膜CD44v6陽性表達(dá)高于在位內(nèi)膜（Z＝－5.610，P＝0.000）與正常內(nèi)膜（Z＝－5.596，P＝0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；內(nèi)異癥在位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜相比，陽性表達(dá)率較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－0.388，P＝0.698）。

表2 3種子宮內(nèi)膜中CD44v6表達(dá)的等級比較

2.3 MMP－9的表達(dá)

MMP－9主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)，陽性細(xì)胞的胞漿被染成棕黃色或棕褐色。3種子宮內(nèi)膜中MMP－9表達(dá)的分布差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。進(jìn)一步兩兩比較，卵巢異位內(nèi)膜MMP－9陽性表達(dá)明顯高于在位內(nèi)膜（Z＝－4.957，P＝0.000）與正常內(nèi)膜（Z＝－5.179，P＝0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜中的陽性表達(dá)略高于正常子宮內(nèi)膜，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－0.388，P＝0.698）。

表3 3種子宮內(nèi)膜中MMP－9的表達(dá)等級比較

2.4 VEGF、CD44v6和MMP－9在異位內(nèi)膜組織中表達(dá)的相關(guān)性

采用兩分類變量的關(guān)聯(lián)性分析，異位內(nèi)膜組VEGF和CD44v6呈正相關(guān)（r1＝0.462，χ2＝42.038，P＝0.000）；MMP－9與CD44v6之間呈正相關(guān)（r2＝0.558，χ2＝70.534，P＝0.000）；MMP－9與VEGF呈正相關(guān)（r3＝0.397，χ2＝29.187，P＝0.000）。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）的發(fā)病機(jī)制不明，眾說紛紜，目前仍以經(jīng)血逆流種植學(xué)說為主導(dǎo)理論。然而有經(jīng)血逆流的婦女中只有10%～15%的人發(fā)生EMS。有些國內(nèi)學(xué)者提出“在位內(nèi)膜決定論”。即內(nèi)膜細(xì)胞在異位處生長、發(fā)育、出血并引起臨床癥狀。CD44v6、MMP－9與VEGF直接影響著異位的子宮內(nèi)膜的黏附、侵襲和局部血管形成等生物學(xué)特性。

3.1 VEGF與EMS的關(guān)系

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血小板衍生生長因子超家族的成員，分子量為34～36KDa，是一種多肽類生長因子。VEGF蛋白主要灶性表達(dá)于腺上皮細(xì)胞的胞漿。Takehara等［2］研究發(fā)現(xiàn)，EMS患者的子宮內(nèi)膜中VEGF－A mRNA和VEGF－C mRNA表達(dá)比非EMS患者明顯增高。近期的研究發(fā)現(xiàn)EMS患者中VEGF基因型和表達(dá)頻率與正常人存在明顯的差異［3］。

本文結(jié)果顯示：免疫組化顯示VEGF陽性細(xì)胞胞漿著色，被染成棕黃色。本研究中VEGF在卵巢異位內(nèi)膜中的表達(dá)均顯著高于在位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜，表明在異位內(nèi)膜中VEGF含量高，與異位內(nèi)膜種植中血管的形成及增生有一定關(guān)系。VEGF是一種多肽類生長因子，主要參與調(diào)控血管生成。其表達(dá)高低反映了該組織的血管生成的活性。異位內(nèi)膜病灶內(nèi)血管的數(shù)量及面積明顯高于在位內(nèi)膜。它直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，通過和血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮增殖和血管生長。同時(shí)，能增加血管通透性，促進(jìn)包括纖維蛋白原在內(nèi)的血漿蛋白的滲出［4］，因而間質(zhì)高度血管化，進(jìn)一步促進(jìn)異位內(nèi)膜的種植和增殖。Fujii等［5］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中VEGF含量增加，VEGF的含量增高，能維持內(nèi)膜異位部位的血管呈現(xiàn)較高的活性，刺激毛細(xì)血管增生，促進(jìn)異位腺上皮細(xì)胞生長的同時(shí)促進(jìn)異位內(nèi)膜在該部位進(jìn)一步增殖和浸潤至盆腔和腹膜內(nèi)組織，增大病灶的深度及范圍，形成腹腔的異位灶，從而加重痛經(jīng)的程度。Nap等［9］研究發(fā)現(xiàn)，抗人類VEGF抗體（HUMV833）可明顯減少EMs鼠模型體內(nèi)異位灶微血管密度，并能抑制內(nèi)膜種植和生長。與本文結(jié)果一致，更有力的證實(shí)了VEGF在EMS的異位內(nèi)膜在異位部位血管形成及種植過程中的重要性。

3.2 CD44v6與EMS的關(guān)系

CD44v6是細(xì)胞黏附分子中的一類，是CD44的一種異構(gòu)體。是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）黏附作用的膜表面糖蛋白，在上皮源性細(xì)胞和腫瘤中表達(dá)。CD44v6是透明質(zhì)酸的主要受體和淋巴細(xì)胞歸巢受體，能改變腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的構(gòu)成及功能，介導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)的粘連，參與細(xì)胞偽足的形成及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。EMS具有惡性腫瘤侵襲性生長的惡性生物學(xué)行為，因而CD44v6在EMS發(fā)病機(jī)制中的作用不容忽視。

本文結(jié)果顯示：CD44v6陽性腺上皮及腔面上皮細(xì)胞胞膜著色，被染成棕黃色，少量細(xì)胞胞漿內(nèi)著色，比胞膜染色淺，間質(zhì)細(xì)胞未見著色。有實(shí)驗(yàn)表明，CD44v6參與了子宮內(nèi)膜細(xì)胞與腹膜表面間皮細(xì)胞黏附，淋巴細(xì)胞歸巢受體的功能，能幫助子宮內(nèi)膜細(xì)胞逃避腹腔液免疫細(xì)胞（NK細(xì)胞）的識別和殺傷，繼而得以存活。CD44v6透明質(zhì)酸受體的作用，可以幫助內(nèi)膜細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞的透明質(zhì)酸配體黏附，異位的內(nèi)膜細(xì)胞更易侵襲種植。本研究認(rèn)為CD44v6在異位癥發(fā)生中促進(jìn)了異位的內(nèi)膜細(xì)胞與周圍組織黏附。

3.3 MMP－9與EMS的關(guān)系

MMP－9是MMPs家族中分子量最大的明膠酶，又稱明膠酶B，分子量92kD，可降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原及彈性蛋白等ECM的主要成分，參與細(xì)胞外基質(zhì)降解和新血管形成，在許多惡性腫瘤組織中均可檢測到MMP－9活性形式的表達(dá)。在子宮內(nèi)膜異位病灶周圍，有著連續(xù)、完整的基底膜，Ⅳ型膠原是其固有成分之一［10］。有實(shí)驗(yàn)表明，MMPs在正常情況下，表達(dá)量很少，而且以無活性的酶原形式存在，而在炎性細(xì)胞因子、激素、生長因子刺激下其表達(dá)量上升及活性增加，如胚胎發(fā)育、血管新生、子宮復(fù)舊、組織修復(fù)與重塑、炎癥反應(yīng)以及腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等情況。Szamatowicz的研究結(jié)果證實(shí)［7］，MMP－9可通過和整合素的相互活化而加強(qiáng)細(xì)胞間的黏附作用，同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽，導(dǎo)致新生血管的形成，從而在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異位黏附、種植和生長的過程中發(fā)揮重要作用。

本文結(jié)果表明：MMP－9在異位內(nèi)膜組陽性表達(dá)率最高，其次為在位內(nèi)膜組和正常內(nèi)膜組，與邱曉紅等［11］研究結(jié)果一致。MMP－9的高表達(dá)表明異位內(nèi)膜細(xì)胞對ECM有著最強(qiáng)的降解能力，利于異位內(nèi)膜的侵襲性種植和生長，進(jìn)而破壞周圍組織，使病變擴(kuò)散，逐漸加重。提示EMS患者異位內(nèi)膜細(xì)胞的生物熱性與在位內(nèi)膜細(xì)胞有差別，前者更具侵襲能力，因而能異位種植，這與沈蓉等［8］研究結(jié)果一致。目前有異位內(nèi)膜孕激素受體顯著低于正常子宮內(nèi)膜的報(bào)道［12］，因子宮內(nèi)異癥、子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜中，增殖期與分泌期的表達(dá)強(qiáng)度無明顯差異，失去了周期性變化規(guī)律。MMP－9的蛋白水解活性破壞局部組織結(jié)構(gòu)及基底膜成分，有利于腹腔的侵襲，同時(shí)在MMP－9促細(xì)胞間黏附和促血管形成的共同作用下，促使逆流入腹腔的內(nèi)膜組織種植生長并使病灶不斷擴(kuò)大。

3.4 VEGF CD44v6及MMP－9在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中的協(xié)同作用

EMS的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟多階段而且多個(gè)細(xì)胞因子相互作用的復(fù)雜過程。VEGF、CD44v6及MMP－9在EMS發(fā)生發(fā)展過程中，有各自獨(dú)特的作用，同時(shí)又緊密關(guān)聯(lián)，相互促進(jìn)。異位的子宮內(nèi)膜細(xì)胞必須具備黏附、侵襲及血管生成3個(gè)基本環(huán)節(jié)，才能在種植部位像腫瘤細(xì)胞一樣生長。首先是異位內(nèi)膜細(xì)胞在CD44v6作用下黏附在種植部位，其次MMP－9發(fā)揮降解基底膜糖蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)成分的作用，增強(qiáng)了異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲能力，再則VEGF促進(jìn)異位部位的血管重建和增生，血管通透性增加，新的纖維及血管化間質(zhì)建立，最終EMS得以發(fā)生和發(fā)展。在這個(gè)過程中，CD44v6為MMP－9定位于細(xì)胞表面提供了受體，同時(shí)可以通過與MMP－9結(jié)合而激活腫瘤壞死因子－β（TGFβ），導(dǎo)致新生的血管生成［13］。血管生成過程中的內(nèi)皮細(xì)胞循環(huán)及血管結(jié)構(gòu)形成均需要MMP－9對ECM的降解和重建，協(xié)同促進(jìn)了EMs的發(fā)生發(fā)展。隨著新藥如MMPs抑制劑和VEGF抑制劑的問世以及在惡性腫瘤中的應(yīng)用，為EMS的治療提供了新的研究方向。

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