楊金玲 江 陽(yáng) 薛 勇 孫成均△
(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,山東 濟(jì)寧272067;2四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院研究生,四川 成都610041)
食品防腐劑能防止由微生物引起的腐敗變質(zhì),延長(zhǎng)食品保質(zhì)期,已廣泛應(yīng)用于食品中,其中包括飲料。由于食品防腐劑均具有一定毒性,須嚴(yán)格按《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]規(guī)定添加,不能超標(biāo)和超范圍使用。為方便飲料中多種防腐劑的快速監(jiān)測(cè),需建立能同時(shí)測(cè)定多種防腐劑的檢測(cè)方法。目前,食品中防腐劑的測(cè)定方法國(guó)內(nèi)外已有許多報(bào)道[2-7]。但現(xiàn)有方法或操作繁瑣、試劑消耗量大、成本高或不能同時(shí)檢測(cè)多種防腐劑。本研究建立了能夠同時(shí)快速檢測(cè)不同種類飲料中10種防腐劑的毛細(xì)管氣相色譜快速分析方法,采用蒽作內(nèi)標(biāo)物質(zhì),優(yōu)化了樣品前處理方法,故本法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn),適用于飲料中多種防腐劑的同時(shí)快速檢測(cè)。
Agilent 6890氣相色譜儀,配備FID檢測(cè)器;標(biāo)準(zhǔn)品丙酸、苯甲酸甲酯、苯甲醇、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、蒽(內(nèi)標(biāo)),含量均大于99%。乙酸乙酯、氯化鈉、鹽酸均為分析純。
色譜柱為FFAP柱(SGE,25m×0.32mm×0.25μm);進(jìn)樣口溫度為250℃,分流比10∶1。程序升溫為初始溫度180℃,保持4min;以40℃/min升至230℃,保持8min。程序升流為初始流速1ml/min,保持3min;以40ml/min升至3ml/min,保持9min;檢測(cè)器溫度為250℃,尾吹流量30ml/min。載氣為氮?dú)猓兌?9.999%),氫氣流量35ml/min,空氣流量350ml/min。進(jìn)樣量1μl。
準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)20.0mg分別置于10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配成濃度均為2.00mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;準(zhǔn)確稱取蒽10.0mg置于10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配成濃度為1.00mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液;分別吸取一定量各儲(chǔ)備液,用乙酸乙酯逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為50~400μg/ml(丙酸),20~200μg/ml(苯甲酸甲酯與苯甲醇),20~240μg/ml(山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類)的混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。
稱?。ɑ蛭。┚鶆蝻嬃蠘悠?.50g(0.50ml)于5ml離心管中(pH值≥4的樣品用鹽酸酸化至pH<4.0),加入少量氯化鈉固體,準(zhǔn)確加入40μl內(nèi)標(biāo)溶液和960μl乙酸乙酯,漩渦混合3min,6000r/min離心1min,吸取上清液置于比色管中,加入1ml乙酸乙酯再提取一次,合并提取液待測(cè)。對(duì)于基體復(fù)雜的樣品,向提取液中再加2ml飽和氯化鈉溶液洗滌,離心后取上清液待測(cè)。
分別進(jìn)樣1μl混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,以各防腐劑濃度對(duì)相應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)(蒽)峰面積之比繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)進(jìn)樣1μl試樣溶液,根據(jù)試樣中被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比,與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較確定進(jìn)樣液中待測(cè)物質(zhì)的含量,再根據(jù)稱樣量和提取液體積計(jì)算樣品中防腐劑含量[8]。
本實(shí)驗(yàn)中各組分沸點(diǎn)和極性差異大,為實(shí)現(xiàn)較好分離,對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇。結(jié)果表明,采用恒溫和恒流模式時(shí),難以實(shí)現(xiàn)完全分離,故采用程序升溫結(jié)合程序升流模式。進(jìn)樣口溫度低于200℃時(shí),沸點(diǎn)高的對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)難以完全氣化,但溫度過(guò)高,與初始柱溫差距較大,部分組分容易在色譜柱中冷凝,故選擇250℃。較低的檢測(cè)器溫度影響結(jié)果的靈敏度,高于250℃時(shí),無(wú)明顯變化,故選擇250℃。由于防腐劑在食品中含量較高,不分流進(jìn)樣容易造成色譜柱過(guò)載,溶劑峰拖尾,但當(dāng)分流比過(guò)大時(shí),分流歧視效應(yīng)增大,沸點(diǎn)高的對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)檢測(cè)靈敏度明顯下降,所以選擇10∶1的分流比。以蒽為內(nèi)標(biāo)物,其結(jié)構(gòu)性質(zhì)與待測(cè)組分接近,保留時(shí)間位于酸與酯類之間,各組分含量對(duì)其與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)在0.9986~1.000之間。在優(yōu)化色譜條件下的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。
圖1 10種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖
采用液—液萃取方式,經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比,發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取效率高,簡(jiǎn)化了操作,且響應(yīng)值最高。對(duì)比了超聲提取和漩渦混合提取的效果,發(fā)現(xiàn)漩渦混合提取的效果優(yōu)于超聲提取。由于食品中防腐劑形態(tài)多是待測(cè)組分的鹽類,如山梨酸鉀和苯甲酸鈉,故需用鹽酸酸化使其轉(zhuǎn)變成分子態(tài)可提高萃取效率。但當(dāng)試樣pH低于4時(shí),無(wú)需酸化。
試驗(yàn)了氯化鈉對(duì)萃取效果的影響。結(jié)果表明,當(dāng)加入氯化鈉時(shí),可有效減少乳化現(xiàn)象,提高萃取效率。對(duì)于基體復(fù)雜的樣品,如乳飲料,其基質(zhì)效應(yīng)明顯,提取液直接測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)干擾嚴(yán)重,且峰形變差。故采用飽和氯化鈉溶液洗滌提取液后測(cè)定,大大減小了雜質(zhì)干擾。
在本色譜條件下,內(nèi)標(biāo)工作曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線之間無(wú)顯著性差異,故用標(biāo)準(zhǔn)曲線代替工作曲線。方法實(shí)際線性范圍很寬,未試驗(yàn)線性范圍上限。各組分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、以3倍噪聲分別計(jì)算的方法檢出限,見表1。
表1 方法線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(n=6)
以酸乳為樣品,加入不同量標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。除對(duì)羥基苯甲酸乙酯低濃度加標(biāo)回收率在85.0%以下,其他各組分都在85.0%~115%之間。
表2 方法加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)
在市場(chǎng)隨機(jī)采集不同種類飲料樣品11份,按本法測(cè)定,結(jié)果表明,所檢飲料中的防腐劑以苯甲酸為主。所檢某冰茶飲料中苯甲酸的含量為0.284g/kg,超出GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定(苯甲酸在碳酸型飲料中最大允許添加量0.2g/kg),而其他樣品中苯甲酸含量均未超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在果酒樣品還同時(shí)檢測(cè)出山梨酸,但未超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在所檢飲料樣品中均未檢出對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑。丙酸在飲料中禁止添加,但在某酸乳飲料中仍檢出丙酸。值得注意的是,在檢出含有防腐劑的6種樣品中,只有2種飲料注明含有防腐劑,其他均未注明。而我國(guó)新頒布的《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》只提出苯甲醇可以添加在食品中,但未明確規(guī)定在食品中的添加限量。這說(shuō)明,飲料行業(yè)不規(guī)范使用食品防腐劑的現(xiàn)象還較常見,某些產(chǎn)品的質(zhì)量仍然不容樂(lè)觀,而我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)仍然有待進(jìn)一步完善。
[1] GB 2760-2011[M].食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn),2011:5-72.
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