奶牛乳房炎溶血性病原菌分離培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)

顧冬花 （青海省大通縣畜牧獸醫(yī)站 810100）

奶牛乳房炎(Mastitis)通常也稱奶牛乳腺炎，是指因微生物感染或因理化刺激引起的一種奶牛乳腺炎癥，其特點(diǎn)是乳中體細(xì)胞尤其是白細(xì)胞增多，以及乳腺組織發(fā)生病理變化。是危害H奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的常見疾病H之一，不僅造成乳性狀異常，品質(zhì)下降，而且隨著抗菌素的反復(fù)長期使用，導(dǎo)致病原菌耐藥菌株的增加和牛奶中抗生素殘留超標(biāo)，嚴(yán)重影響人類身體健康，甚至?xí)：κ称沸l(wèi)生和公共衛(wèi)生安全。近年來，隨著奶牛畜產(chǎn)品市場價(jià)格的不斷上漲，規(guī)模奶牛養(yǎng)殖業(yè)的相繼建成，由于在實(shí)際生產(chǎn)中缺乏專業(yè)的飼養(yǎng)管理人員，缺乏預(yù)防意識，再加上對疾病的了解、認(rèn)識及防治意識薄弱，在不清楚病因的情況下，亂用、濫用抗生素，結(jié)果造成耐藥細(xì)菌越來越多，耐藥范圍越來越廣，給臨床治療帶來困難。鑒此，為了明確掌握大通縣某奶牛場引起奶牛乳房炎的主要致病菌，筆者于2012年12月采集該牛場癥狀嚴(yán)重病牛的乳樣進(jìn)行了細(xì)菌分離培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，為指導(dǎo)本場合理有效的用藥提供了科學(xué)依據(jù)，對有效控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生及傳播具有重要意義。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 藥敏紙片 藥敏紙片購于杭州生物試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器 離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、酒精燈、顯微鏡、平皿、錐形瓶、接種針、超凈工作臺等。

1.4 奶樣 無菌采集大通縣某奶牛場奶牛乳房炎癥狀嚴(yán)重病牛的乳樣。

2 方法

2.1 奶樣采集 準(zhǔn)備滅菌離心管和消毒酒精棉。用溫水徹底清洗患乳房炎奶牛的乳房，然后用75%的酒精棉對乳房消毒，待酒精揮發(fā)后無菌采集乳樣，棄去前3把乳，收集第3把以后的乳樣，每區(qū)采集1份5～10ml到無菌離心管中，立即送回實(shí)驗(yàn)室檢查，不能及時(shí)送檢的保存在4℃冰箱中。

2.2 溶血菌分離培養(yǎng) 將采集的奶樣以3000r/min離心15min，棄去上層液體，保留沉淀在底部的奶樣和少量液體，將底部奶樣無菌操作分別接種在綿羊血瓊脂平板和營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果，初步篩選含溶血的菌落。

2.3 革蘭氏染色 用滅菌接種針分別挑取兩種溶血性菌落，涂片，然后用革蘭氏染液進(jìn)行染色，待干后鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。

2.4 溶血菌分離純培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn) 再挑取革蘭氏染色為陽性的溶血性鏈球菌無菌操作分別接種于新的綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫純化培養(yǎng)18～24h。取2個(gè)無菌EP管，各裝200μl無菌生理鹽水，分別挑去多量純化培養(yǎng)的菌落于無菌生理鹽水中稀釋，用移液器移去100μl稀釋菌液到新的綿羊血瓊脂平板上，用L棒將菌液涂布均勻，放置3min，然后用滅菌鑷子將阿莫西林、氯霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、先鋒V號、四環(huán)素藥敏紙片貼于平板上，6片藥敏片/培養(yǎng)皿，每個(gè)菌設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺測量每個(gè)藥敏片的抑菌環(huán)直徑。

2.5 敏感性判定標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會CLSI的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，通過抑菌圈直徑大小判定病原菌對藥物的敏感性、中介和耐藥性。

3 結(jié)果

3.1 溶血菌分離培養(yǎng)結(jié)果 經(jīng)24h培養(yǎng)，接種奶樣的營養(yǎng)瓊脂平板上長出一種灰白、半透明、表面光滑、邊緣整齊、稍隆起的露珠樣小菌落，透光觀察菌落略顯藍(lán)色；接種奶樣的綿羊血瓊脂平板上也長出類似的菌落，并出現(xiàn)α和β溶血現(xiàn)象。

3.2 革蘭氏染色結(jié)果 經(jīng)革蘭氏染色兩種溶血菌落均為革蘭氏陽性菌，鏡下觀察到兩種菌落排列成鏈狀，α-溶血菌成單個(gè)鏈狀存在，鏈短且多；β-溶血菌鏈成對存在，鏈長且少，說明α、β兩種溶血菌都是革蘭氏陽性鏈球菌。

3.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，該奶牛場α-溶血性鏈球菌對阿莫西林、慶大霉素、紅霉素、青霉素、先鋒V號耐藥，對氯霉素、四環(huán)素敏感，對鏈霉素、環(huán)丙沙星中介；β-溶血性鏈球菌對阿莫西林、慶大霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、先鋒V號耐藥，對氯霉素、四環(huán)素敏感，對鏈霉素中介。結(jié)果見附表。

附表 被檢溶血性鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 (mm)

4 討論

（1）本試驗(yàn)在大通某奶牛場不同奶牛乳房炎病例的奶樣中分離得到2種溶血性鏈球菌，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色等試驗(yàn)證明該奶牛場的主要致病菌是α和β溶血性鏈球菌，而且兩種鏈球菌具有多重耐藥性，奶牛養(yǎng)殖業(yè)主為了獲得高產(chǎn)奶量，提高經(jīng)濟(jì)效益，常常使用大量抗生素預(yù)防與治療乳房炎，這也正是導(dǎo)致耐藥菌株增加，給奶牛乳房炎治療帶來困難的原因之一。因此，為了明確指導(dǎo)該奶牛場乳房炎治療時(shí)有效合理的用藥，本試驗(yàn)對分離的兩種溶血性鏈球菌作了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示治療該奶牛場乳房炎的最佳抗生素是氯霉素、四環(huán)素，其次是鏈霉素。建議在使用抗生素的基礎(chǔ)上，同時(shí)采用中草藥方劑進(jìn)行治療和物理輔助治療。（2）奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)面臨的一個(gè)重大難題，凡是養(yǎng)殖奶牛的國家，都有乳房炎的存在，并且引起奶牛乳房炎的原因也比較復(fù)雜，溶血性鏈球菌在自然界分布較廣，存在于空氣、水、塵埃、糞便及健康人和動物的口腔、咽喉等，可通過直接接觸、空氣飛沫或皮膚、粘膜傷口感染；因此，防治本病應(yīng)采取綜合措施：堅(jiān)持預(yù)防為主，防治結(jié)合的原則。保持牛體和牛舍的清潔、干燥，擠奶前后乳房的嚴(yán)格消毒、擠奶儀器清潔消毒、操作人員衛(wèi)生健康等；加強(qiáng)飼養(yǎng)管理制度，根據(jù)奶牛在不同生產(chǎn)階段的營養(yǎng)需求給予合理的膳食，維持機(jī)體最佳生產(chǎn)技能，降低產(chǎn)乳期和干乳期的發(fā)病率；H奶牛場要定期對生產(chǎn)奶牛進(jìn)行健康體檢，一旦發(fā)現(xiàn)患乳房炎的奶牛應(yīng)立即隔離治療H，較嚴(yán)重者可以淘汰，對病牛使用的一切用具及環(huán)境進(jìn)行徹底消毒處理；奶牛場定期進(jìn)行乳房炎的細(xì)菌分離和藥敏試驗(yàn)，以便更好的指導(dǎo)奶牛場疾病的防控和合理用藥。

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