地塞米松的誘導(dǎo)效應(yīng)對異煙肼大鼠肝毒性的影響

王來友，陳玲燕，程 寶，畢惠嫦，胡因銘

(1.廣東藥學(xué)院中醫(yī)藥研究院，廣東廣州 510006;2.中山大學(xué)臨床藥理研究所，廣東 廣州 510006)

利福平(rifampicin，RIF)與異煙肼(isoniazid，INH)均是臨床上預(yù)防和治療結(jié)核的一線藥物，通常需聯(lián)合應(yīng)用，但也引起諸多不良反應(yīng)，其中肝毒性最為嚴(yán)重。INH在與RIF合用的情況下，其肝損傷發(fā)生率明顯增加，部分調(diào)查顯示可達(dá)28%［1］。INH所引起的肝損傷為細(xì)胞毒性，其發(fā)生原因復(fù)雜，迄今對其確切的發(fā)生機(jī)制尚無明確認(rèn)識(shí)［2］。最近，研究者們發(fā)現(xiàn)人肝臟藥物代謝酶CYP3A4與INH導(dǎo)致的肝細(xì)胞毒性有關(guān) 。在過表達(dá)CYP3A4的HepG2細(xì)胞體系中，用 0.1 － 100 μmol·L－1INH 處理后，相對于對照組，細(xì)胞存活率明顯下降，但加入CYP3A4抑制劑酮康唑后，細(xì)胞存活率又恢復(fù)至空白對照組水平［3］。Yoshikawa 等［4］的實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了CYP3A4可以明顯介導(dǎo)INH產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。另有報(bào)道RIF可以增加INH對人肝細(xì)胞的毒性，但是不能增加對大鼠肝細(xì)胞的毒性［5］。迄今國內(nèi)外尚未獲得CYP3A參與INH肝毒性的體內(nèi)證據(jù)。

RIF是肝微粒體代謝酶的誘導(dǎo)劑，可強(qiáng)烈的激活人孕烷X受體(human pregnane X receptor，hPXR)。但PXR有很強(qiáng)的種族特異性，RIF對hPXR有特異性激活作用，對嚙齒類動(dòng)物PXR的激活作用相當(dāng)弱或無［6］。因而本實(shí)驗(yàn)用大鼠的特異性PXR激活劑地塞米松(dexamethasone，DEX)代替hPXR激活劑RIF，為臨床上抗結(jié)核藥物RIF-INH聯(lián)合應(yīng)用所導(dǎo)致的肝損傷提供動(dòng)物模型，并探討CYP3A在其中的意義，為進(jìn)一步的深入機(jī)制研究和防治策略提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及試劑DEX購自美國Alfa Aesar(天津)化學(xué)有限公司，INH、咪達(dá)唑侖購自美國Sigma-Aldrich公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒購自北京利德曼生化股份有限公司，總膽固醇(TC)和總甘油三酯(TG)測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司;大鼠肝微粒體蛋白酶抑制劑購自Thermo Scientific公司，氯化鈉、無水乙醇、甲醛、K2HPO4、KH2PO4等購自廣州化工試劑廠，為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器切片機(jī)(浙江寶華無線電廠);YD-bL智能型生物細(xì)胞包埋機(jī)冷凍臺(tái)、KD-BMⅡ電腦生物細(xì)胞包埋機(jī)、KD-TS1生物細(xì)胞自動(dòng)脫水機(jī)(浙江省寶華市科迪儀器設(shè)備有限公司);奧林巴斯IX71倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，TSQ-Quantum型液相色譜－質(zhì)譜儀(美國Finnigan公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料SPF級(jí) Sprague-Dawley(SD)♂大鼠，270～300 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔SCXK(粵)2008-0002〕。含DEX飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并加工:將160 mg DEX均勻地混合在8 kg大鼠飼料中，加工至每公斤大鼠飼料含DEX 20 mg，鈷輻照滅菌，SPF級(jí)包裝。1 000 mg·L－1INH溶液的配制:用電子分析天平精確稱取1g INH，用1 000 ml高壓滅菌水配制成1 000 mg·L－1INH溶液。分裝于500 ml飲用水瓶中，備用。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組、給藥劑量及給藥途徑24只♂SD大鼠按體重隨機(jī)分成4組，每組6只，單籠喂養(yǎng)。分別按每日 0.5 mg·kg－1和 50 mg·kg－1灌胃給藥劑量配備相應(yīng)的DEX飼料和INH飲用水。具體給藥方式及途徑如下:(1)空白對照組:給予普通飼料和空白飲用水;(2)DEX對照組:給予含DEX的飼料和空白飲用水;(3)INH組:給予普通飼料和含INH的飲用水;(4)DEX-INH組:給予含DEX的飼料和含INH的飲用水。于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)28 d，動(dòng)物室內(nèi)溫度20℃ ～25℃、相對濕度40% ～70%，換氣次數(shù)10～15次/h，保持12 h光照循環(huán)。

2.2 肝組織病理形態(tài)學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，可自由飲用不含INH的普通水。頸椎脫臼處死大鼠后立即開腹，取出肝臟，用刀片在肝臟最大葉距離邊緣1/5處取出寬約3 mm，長約2 cm的肝臟組織，立即放入10%中性福爾馬林中。10 d后取出肝臟組織，經(jīng)取材、固定、組織脫水、透明、浸臘、包埋、切片、裱片及烤片、HE染色、封片等程序后，對各組大鼠的肝臟組織切片進(jìn)行圖像采集，并用Image-Pro Plus 6.0軟件對組織中的特征病變區(qū)域面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用按點(diǎn)計(jì)數(shù)方式評(píng)估肝損傷的嚴(yán)重程度［7］。

2.3 CYP3A活性測定采用差速超速離心法制備肝微粒體。取實(shí)驗(yàn)后冷凍保存的肝樣品稱重后，用冰冷的蔗糖溶液洗滌后，轉(zhuǎn)移至塑料管中。每100 mg肝加入含蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液(320 mmol·L－1蔗糖，50 mmol·L－1KH2PO4，1 mmol·L－1EDTA)600 μl，上下均勻移動(dòng)塑料管20 s，避免泡沫產(chǎn)生，制備勻漿，4℃下9 000×g離心20 min，取上清液，100 000 ×g，4℃下離心 60 min，棄上清。下層沉淀潤洗后，重新混懸于含冰凍緩溶液(100 mmol·L－1K2HPO4/KH2PO4，20%(V/V)甘油，1 mmol·L－1EDTA)中，混勻，分裝成兩份，－80℃ 凍存?zhèn)溆茫謩e用于總蛋白含量測定和CYP3A1/2活性檢測。BCA法測定肝微粒體蛋白質(zhì)濃度。參考實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法，咪達(dá)唑侖用作測定CYP3A活性的探針?biāo)幬铮?］。即分別用制備的不同組的含0.25 g·L－1大鼠肝微粒體在200 μl體系中于37℃體外預(yù)孵育 5 min 后，加入 20 mmol·L－1NADPH 10 μl啟動(dòng)反應(yīng)，輕搖30 min后加入冰冷的乙腈200 μl終止反應(yīng)。旋渦振蕩2 min，靜置10 min，20 000 × g離心10 min，取上清液進(jìn)樣10 μl，LC-MS檢測咪達(dá)唑侖代謝產(chǎn)物1’-羥基咪達(dá)唑侖的含量。

2.4 血清中各種生化指標(biāo)的檢測在從大鼠取肝組織前，眼眶靜脈叢采血約2 ml，1 000×g離心5 min。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取出200 μl血清，采用日立7020全自動(dòng)生化分析儀按照試劑盒測定血清中ALT、AST和ALP水平以及TC和TG的濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行方差分析，組間比較采用Dunett t檢驗(yàn)方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 肝組織病理形態(tài)學(xué)檢查如代表性肝組織切片F(xiàn)ig 1所示，6只對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉清晰可見，肝細(xì)胞排列較整齊，匯管區(qū)未見膽管增生，未見炎細(xì)胞浸潤;INH組(5/6)大鼠肝部分區(qū)域(25.6% ±4.2%)區(qū)域發(fā)生輕微水腫(黑色箭頭所示)，其余結(jié)構(gòu)未見異常;DEX組大鼠匯管區(qū)膽管輕微增生(3.2% ±1.5%)，均出現(xiàn)局灶性肝細(xì)胞梗死(7.4% ±2.3%)，如Fig 1 DEX中黑色五角星所示。INH-DEX合并給藥后，1只大鼠在d 20出現(xiàn)死亡，其余5只大鼠均出現(xiàn)大片狀程度不一的肝細(xì)胞(71.2% ±13.6%)梗死(如五角星所示)，梗死區(qū)周圍較多肝細(xì)胞(40.1% ±11.8%)水腫(如箭頭所示)，肝臟損傷程度明顯加劇，肝損傷分值明顯高于對照組和INH組(P＜0.01)，提示肝臟損傷程度明顯加劇。

Fig 1 Representative liver section of rats treated with DEX-containing diet(20 mg·kg－1，W/W)and INH-containing water(1000 mg·L－1，W/V)for 28 days(HE ×200)

3.2 肝指數(shù)與CYP3A活性如Tab 1所示，服用INH后，大鼠肝臟指數(shù)與CYP3A活性與對照組相比無明顯變化。但服用DEX后，與對照組相比其肝指數(shù)明顯增加，CYP3A活性增加了2.58倍(P＜0.01)。而 DEX與 INH合用組，其肝臟指數(shù)與CYP3A活性與 DEX組差別不明顯(P＞0.05)，CYP3A活性與對照組相比增加了近3倍(P＜0.01)。因此可以看出，與對照組相比，DEX與INH合用后其增加的肝臟指數(shù)與CYP3A活性主要來自于DEX。

Tab 1 Liver index and relative hepatic CYP3A activity in rats treated with DEX-containing diet(20 mg·kg－1，W/W)and INH-containing water(1 000 mg·L－1，W/V)for 28 days( ± s，n=5 ～ 6)

Tab 1 Liver index and relative hepatic CYP3A activity in rats treated with DEX-containing diet(20 mg·kg－1，W/W)and INH-containing water(1 000 mg·L－1，W/V)for 28 days( ± s，n=5 ～ 6)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Liver index CYP3A relative activity Control 3.84 ±0.06 1.00 ±0.15 INH 3.95 ±0.07 1.19 ±0.18 DEX 5.26 ±0.09＊＊ 2.58 ±0.42＊＊DEX+INH 5.65 ±0.23＊＊ 2.99 ±0.45＊＊

3.3 血清生化檢測結(jié)果如Tab 2所示，飲用含1 000 mg·L－1INH的水28 d，大鼠血清中 AST和ALP水平均無明顯變化(P＞0.05)，ALT略有升高，但TC和TG均明顯升高(P＜0.05)，表明長期單用INH能增加大鼠的脂質(zhì)水平。服用DEX后，其ALT和TC均有升高(P＜0.05)，而AST、ALP和TG水平明顯增加(P＜0.01)。DEX-INH兩藥合用后，血清中所檢測的ALT、AST、ALT、TC和TG五項(xiàng)指標(biāo)均明顯上升(P＜0.01)，與對照組相比，其肝細(xì)胞損傷指標(biāo)ALT上升了3.7倍，AST上升了2.7倍，與肝組織切片觀察的結(jié)果相一致。而與INH組相比，除TG水平有上升外(P＜0.05)，其它4項(xiàng)指標(biāo)差異均有顯著性(P＜0.01)。

4 討論

抗結(jié)核藥物所導(dǎo)致的肝損傷一直是臨床上結(jié)核患者依從性較差的主要原因。到目前為止，尚沒有能完全模擬臨床實(shí)際情況的整體動(dòng)物模型，其主要原因還是在于種屬差異性，也給進(jìn)一步的機(jī)制和防治策略研究帶來障礙。一些學(xué)者認(rèn)為INH的肝毒性與N-乙?；D(zhuǎn)移酶(NAT)和CYP2E1介導(dǎo)產(chǎn)生的毒性中間產(chǎn)物有關(guān)。其毒性代謝產(chǎn)物推測為肼(hydrazine)和乙酰肼(acetylhydrazine)［9］。然而分別用這兩種代謝產(chǎn)物100 mg·kg－1的劑量處理C57BL/6小鼠時(shí)，卻并不發(fā)生明顯的藥物性肝損傷［10］。而本實(shí)驗(yàn)中，用大鼠的特異性PXR激活劑DEX后，CYP3A的活性明顯增加，同時(shí)也明顯增強(qiáng)了INH的肝毒性，表明 CYP3A可能與臨床上RIFINH合用所導(dǎo)致的肝毒性有關(guān)。張志華等［11］利用人肝細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，葡萄柚汁中的CYP3A4抑制劑柑桔素能明顯減輕INH和RIF合用的肝細(xì)胞毒性，進(jìn)一步提示對CYP3A活性進(jìn)行調(diào)節(jié)可能對防治RIF-INH所導(dǎo)致的肝損傷具有重要意義，但仍需更直接的體內(nèi)證據(jù)進(jìn)一步提供支持。

本實(shí)驗(yàn)利用含DEX的飼料和含INH的水自然給藥的方式。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一只280 g左右的SD大鼠大約日消耗15 g左右的飼料和30 ml左右的飲用水，利用率均為50%左右。因而我們用的含20 mg·kg－1DEX的飼料近似于灌胃給藥的等效劑量為 0.5 mg·kg－1，含 1 000 mg·L－1INH 的水近似于灌胃給藥的等效劑量為50 mg·kg－1。

在我們檢測的血清學(xué)指標(biāo)中，DEX的使用均導(dǎo)致AST/ALT＞1，提示肝細(xì)胞線粒體損傷嚴(yán)重。然而，有研究提示DEX能通過抑制氧化應(yīng)激對非甾體抗炎藥雙氯芬酸鈉的肝損傷有保護(hù)作用［12］，造成這種相反結(jié)果的原因可能與DEX應(yīng)用的時(shí)程和DEX能同時(shí)激活糖皮質(zhì)激素受體等其它靶點(diǎn)相關(guān)。另外，在我們復(fù)制的DEX-INH導(dǎo)致的大鼠慢性肝毒性模型中，除觀察到肝損傷的指標(biāo)ALT、AST和ALP在DEX于INH合并后明顯提高外，其脂質(zhì)水平TC和TG也有明顯提高。已有研究報(bào)道RIF會(huì)導(dǎo)致臨床上的高脂血癥［13］，最新的研究也表明INH能使小鼠血清脂質(zhì)水平升高［14］。有報(bào)道RIF-INH的合用產(chǎn)生的肝損傷可能與其升高的脂質(zhì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的增加有關(guān)［15］。結(jié)合上述研究結(jié)果，“降脂調(diào)肝”策略可能是防治抗結(jié)核藥物性肝損傷的一個(gè)新的選擇。

Tab 2 Effect of INH，DEX and INH-DEX treatment on serum ALT，AST，ALP，TC and TG level in rats(±s，n=5－6)

Tab 2 Effect of INH，DEX and INH-DEX treatment on serum ALT，AST，ALP，TC and TG level in rats(±s，n=5－6)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs INH group

Group ALT/U·L－1 AST/U·L－1 ALP/U·L－1 TC/mmol·L－1 TG/mmol·L －1 Control 69.0 ±8.7 120.1 ±11.4 99.1 ±18.6 2.29 ±0.42 0.88 ±0.22 INH 74.7 ±9.1 110.7 ±16.8 95.7 ±14.9 4.10 ±0.58* 1.68 ±0.36*DEX 99.6 ±9.7* 208.0 ±18.8＊＊ 170.2 ±19.3＊＊ 4.15 ±0.66* 1.96 ±0.21＊＊DEX+INH 256.1 ±32.2＊＊△△ 325.3 ±29.8＊＊△△ 256.9 ±21.7＊＊△△ 8.32 ±0.98＊＊△△ 2.68 ±0.35＊＊△

綜上所述，含 DEX 20 mg·kg－1的飼料和含1 000 mg·L－1INH的水喂養(yǎng)28 d后的大鼠能明顯地出現(xiàn)肝損傷，其機(jī)制可能與DEX上調(diào)CYP3A活性或增加的脂質(zhì)過氧化物有關(guān)。因而，選擇性的CYP3A抑制劑柑桔素或抗氧化類的降脂藥物如普羅布考或許對其有保護(hù)作用，但尚需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，以帶給臨床上RIF-INH所致肝損傷結(jié)核患者直接的臨床獲益。

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