蜂毒素對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞生長的抑制作用及其機(jī)制探討

于明哲，李 俊，黃 成，徐 濤，吳小琴，李小楓

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032)

蜂毒素(mellitin)是蜂毒的主要活性成分，具有廣泛的生物學(xué)及藥理學(xué)作用。目前研究發(fā)現(xiàn)蜂毒素具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤等生物學(xué)效應(yīng)［1－2］。細(xì)胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1，Cyclin D1)近年來在細(xì)胞增殖中的作用引起人們的廣泛注意，細(xì)胞在從G1期進(jìn)入S期的過程中，Cyclin D1與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)起著非常重要的作用［3－4］，而進(jìn)入 S期所必需的一些基因的表達(dá)又受到轉(zhuǎn)錄因子(E2F)家族的調(diào)控［5］。Cyclin D1/CDK4-E2F通路在蜂毒素引起的細(xì)胞周期改變中的作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用蜂毒素體外干預(yù)MRC-5，觀察藥物對(duì)MRC-5體外增殖的抑制作用及其Cyclin D1/E2F信號(hào)通路的關(guān)系，擬為臨床肺纖維化的治療提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株人胚肺成纖維細(xì)胞株(MRC-5)，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑蜂毒素由安徽省百春制藥廠提供(批號(hào):20091022);胎牛血清，杭州四季青公司;DMEM高糖培養(yǎng)基，Hyclone;TRIzol，美國 Sigma;Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)erments公司;細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，碧云天;小鼠抗β-actin抗體，Santan Cruz公司;兔抗p21及E2F-1，武漢博士德公司;兔抗Cyclin D1及CDK4，HRP標(biāo)記的辣根過氧化物酶二抗，北京中杉金橋公司;PCR引物由上海生工生物公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材MK3型酶標(biāo)儀，荷蘭雷勃公司產(chǎn)品;SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)，江蘇蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;NAPCO-6100型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國SHELLAB公司產(chǎn)品;PCR擴(kuò)增儀，德國Eppedorf公司產(chǎn)品;Bio-rad電泳儀，美國伯樂公司產(chǎn)品;COULTZER EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀，美國Beckman Counter公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 MRC-5細(xì)胞的培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%、CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70% ～80%密度時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 正常組:作為各處理組的共同對(duì)照;蜂毒素處理組:設(shè) 0.5、1、2、4、8 mg·L－1濃度組。每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1×108·L－1的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔約100 μl，37℃過夜。待細(xì)胞完全貼壁后加入蜂毒素，分別作用12、24、48 h后，棄去培養(yǎng)基，換無血清培養(yǎng)液，然后每孔加MTT(5 g·L－1)20 μl，37℃繼續(xù)孵育 4 h 后，棄上清并每孔加150 μl二甲基亞砜溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，室溫振蕩溶解10 min后，于490 nm波長處測吸光度(A值)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長期MRC-5細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L－1，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h至貼壁。加入濃度分別為1、2、4 mg·L－1的蜂毒素(用 PBS 稀釋)，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，作用24 h后，PBS洗細(xì)胞3 次，胰蛋白酶消化，1 500 r·min－1離心 5 min，重復(fù)以上操作3次，收集細(xì)胞沉淀。70%冷乙醇固定過夜，24 h后離心去上清，加入PI染液，室溫下進(jìn)行脫氧核糖核酸(DNA)染色30 min，樣品4℃避光保存。應(yīng)用Beckman流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。計(jì)算細(xì)胞周期各時(shí)相DNA的百分含量。

2.4 RT-PCR 檢測MRC-5中Cyclin D1、CDK4 及E2F-1mRNA的表達(dá)采用TRIzol法提取MRC-5總RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。下列PCR引物(Tab 1)均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:Cyclin D1，94℃變性40 s，58℃復(fù)性40 s，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，CDK4，94℃變性 40 s，61℃復(fù)性 40 s，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán);E2F-1，94℃變性 40 s，53℃復(fù)性40 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測光密度。采用β-actin為內(nèi)參照，分別以相應(yīng)基因與β-actin光密度比值表示該基因相對(duì)表達(dá)水平。

Tab 1 PCR primers and length of amplification

2.5 Western blot檢測 Cyclin D1、CDK4、p21 及E2F-1的蛋白表達(dá)取經(jīng)處理24 h后的細(xì)胞，加500 μl RIPA 細(xì)胞裂解液，20 μl蛋白酶抑制劑，5 μl PMSF于冰上裂解25 min后置于4℃離心機(jī)上12 000 r·min－1，離心 30 min。取上清，用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量。加入SDS上樣緩沖液，100℃，加熱10 min使蛋白變性。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上。室溫下用5%的脫脂奶粉封閉3 h，膜清洗后加入一抗，一抗的稀釋濃度為:Cyclin D1(1∶500稀釋)、CDK4(1∶500稀釋)、p21(1∶200稀釋)及E2F-1(1∶200稀釋)，4℃過夜。再分別加入與一抗相匹配的二抗(1∶8 000稀釋)，室溫放置1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參照，分別以相應(yīng)蛋白與β-actin光密度比值表示該蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 蜂毒素對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的抑制作用MTT結(jié)果顯示(Tab 2)，與空白對(duì)照組相比，蜂毒素各濃度組(0.5、1、2、4、8 mg·L－1)對(duì) MRC-5 細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，且隨著藥物作用時(shí)間延長及藥物濃度的增加而增強(qiáng)。

Tab 2 Effects of Melittin on proliferation of MRC-5 cells(±s，n=3)

Tab 2 Effects of Melittin on proliferation of MRC-5 cells(±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group

Group Dose/mg·L－1 12 h/A490 24 h/A490 48 h/A 490 Control － 0.337 ±0.039 0.453±0.051 0.568 ±0.084 Melittin 0.5 0.328 ±0.032 0.433±0.046 0.500 ±0.089*1 0.311 ±0.035 0.361±0.050＊＊ 0.429 ±0.053＊＊2 0.296 ±0.028 0.335±0.045＊＊ 0.406 ±0.062＊＊4 0.273 ±0.030* 0.291±0.024＊＊ 0.313 ±0.036＊＊8 0.249 ±0.021＊＊ 0.288±0.036＊＊ 0.289 ±0.047＊＊

3.2 蜂毒素對(duì)MRC-5細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測，MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞周期均受到不同程度的影響，與空白對(duì)照組相比，在蜂毒素(1、2、4 mg·L－1)作用細(xì)胞24 h后，G0/G1期 DNA相對(duì)增多。對(duì)照組G0/G1期DNA比例為40.4% ±3.76%，蜂毒素(1、2、4 mg·L－1)作用 24 h 后，G0/G1期 DNA的含量升高到 50.67% ±4.82%(P＜0.05)、57.12% ±6.01%(P ＜0.01)、56.00% ±5.81%(P＜0.01)，且4 mg·L－1的蜂毒素處理組有部分凋亡。見Fig 1。

3.3 蜂毒素對(duì) MRC-5細(xì)胞中 Cyclin D1、CDK4、E2F-1的mRNA表達(dá)的影響MRC-5細(xì)胞經(jīng)不同濃度蜂毒素(1、2、4 mg·L－1)處理 24 h 后，Cyclin D1、CDK4、E2F-1 mRNA的表達(dá)下降，且具有濃度依賴性(P ＜0.05;P＜0.01)，見 Fig 2。

3.4 蜂毒素對(duì) MRC-5細(xì)胞中 Cyclin D1、CDK4、E2F-1的蛋白表達(dá)的影響MRC-5細(xì)胞經(jīng)不同濃度蜂毒素(1、2、4 mg·L－1)處理 24 h 后，p21 蛋白表達(dá)升高，Cyclin D1、CDK4、E2F-1蛋白的表達(dá)下降，且具有濃度依賴性(P＜0.05;P＜0.01)，見Fig 3。

4 討論

肺纖維化是多種原因引起的慢性肺疾病發(fā)展到晚期的共同病理變化，其集中表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積［6－7］。因此，尋找有效藥物抑制肺成纖維細(xì)胞的過度增殖是防治肺纖維化的一種有效手段。蜂毒素是蜂毒的主要組成及活性成分，具有高度的藥理作用和生物學(xué)活性，可以通過多種途徑影響細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)尚有抗肝纖維化作用［8］，但其對(duì)肺纖維化的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):蜂毒素對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)隨著藥物作用時(shí)間的延長及濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。

肺成纖維細(xì)胞的過度增生和分泌膠原在肺纖維化形成過程中扮演了重要的角色［9］。細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期蛋白(cyclins)表達(dá)有密切關(guān)系。細(xì)胞周期主要由細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)以及細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKI)所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蜂毒素可以影響人胚肺成纖維細(xì)胞周期的正常移行，阻止G1期細(xì)胞向S期的轉(zhuǎn)變，使細(xì)胞停滯于G0/G1期，減少了DNA合成和有絲分裂，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。因此推測蜂毒素很可能是通過影響G1期周期調(diào)節(jié)因子的活性而發(fā)揮周期調(diào)控作用。

Cyclin D1為細(xì)胞周期G1期的正性調(diào)控蛋白，Cyclin D1與CDK4形成復(fù)合物，驅(qū)使細(xì)胞通過R點(diǎn)(restriction point)由G1期進(jìn)入S期而發(fā)揮促增殖作用［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蜂毒素(1、2、4 mg·L－1)下調(diào)Cyclin D1及CDK4的表達(dá)，使細(xì)胞不能通過R點(diǎn)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期限制點(diǎn)主要存在于G1/S期，當(dāng)細(xì)胞通過該限制點(diǎn)，細(xì)胞周期進(jìn)程向下進(jìn)行將不可避免。調(diào)控G1/S期以及DNA合成的相關(guān)基因的表達(dá)主要受E2F家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)［11－12］。轉(zhuǎn)錄因子E2F-1是E2F家族中的成員之一，是細(xì)胞周期G1期向S期過渡的重要調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖過程中起著關(guān)鍵作用。本研究中蜂毒素(1、2、4 mg·L－1)下調(diào) MRC-5 中 E2F-1 的表達(dá)，使細(xì)胞生長停滯在G0/G1期。

p21，是一種廣泛的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDKS)抑制物，其通過與Cyclin競爭性結(jié)合CDK以及抑制Cyclin D/CDK復(fù)合物的活性而發(fā)揮限制細(xì)胞周期進(jìn)程的作用［13］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)蜂毒素抑制細(xì)胞生長，并且下調(diào)Cyclin D1和CDK4表達(dá)，上調(diào)p21表達(dá)。

Fig 3 Protein expressions of Cyclin D1，CDK4，p21 and E2F-1 in MRC-5 cells(±s，n=3)

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)了蜂毒素能有效抑制MRC-5細(xì)胞增殖，可阻滯MRC-5細(xì)胞于G0/G1期，該作用可能與蜂毒素抑制Cyclin D1、CDK4及E2F-1的表達(dá)，上調(diào)p21的表達(dá)有關(guān)，提示蜂毒素可能通過抑制Cyclin D1/E2F信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗纖維化作用。

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