樹豆脂溶性部位對糖尿病和肥胖小鼠骨密度及血脂水平的影響

葉貴福，王 璐，楊瑞儀，田汝華，胡英杰，沈小玲

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所中藥新藥發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510405)

骨質(zhì)疏松癥是一種常見病，主要累及老年人，其特點(diǎn)是骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)受損和脆性骨折的風(fēng)險增加［1－2］。肥胖和糖尿病是常見的內(nèi)分泌疾病，能夠引起或者加速骨質(zhì)疏松的發(fā)生［3－4］。因此認(rèn)為通過控制血糖和血脂，可以減少糖尿病和肥胖癥患者的骨丟失，提高骨密度，改善骨質(zhì)疏松癥狀［4－5］。

樹豆(Cajanus cajan L.Millspaugh)是蝶形花科(Papilionaceae)木豆屬(Cajanus DC.)多年生灌木［6］。樹豆嫩枝葉的水提取物能促進(jìn)壞死股骨頭的修復(fù)、促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長、改善雌激素缺乏所致骨質(zhì)疏松等，在臨床上被用于治療缺血性股骨頭壞死［7］。樹豆脂溶性部位有降血糖和血脂的作用［8－9］，該部位的主要化學(xué)成分與水溶性部位成分差異十分明顯［10］。當(dāng)前樹豆對骨的作用研究主要集中在其水溶性部位，對脂溶性部位的研究較少，僅見鄭元元等［11］報道樹豆的茋類提取物具有改善雌激素缺乏大鼠骨質(zhì)丟失的作用。未見有關(guān)樹豆用于治療糖尿病性或肥胖性骨質(zhì)疏松的研究報道。

db/db小鼠是一種先天肥胖糖尿病小鼠，4周齡時體重和血糖開始明顯上升。在長期的高血糖后，db/db小鼠會相繼出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥，這些并發(fā)癥包括骨質(zhì)疏松癥的出現(xiàn)［4］。ob/ob小鼠是一種先天肥胖高血糖小鼠，4周齡時即出現(xiàn)增重加速并很快出現(xiàn)肥胖表型并伴有高血糖［12］，ob/ob小鼠存在著體內(nèi)脂肪組織異常分布、過度堆積的情況，并且脂肪組織呈現(xiàn)持續(xù)性增長，這些因素都有可能引起或加劇骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

鑒于此，我們選擇db/db小鼠和ob/ob小鼠作為肥胖和糖尿病性骨質(zhì)疏松模型，評價了樹豆脂溶性部位改善高血糖及肥胖所導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥狀的能力。

1 材料與方法

1.1 樹豆脂溶性部位的制備取干燥樹豆枝葉1 000 g，切成小段，置于10 L圓底燒瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇6 L回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓回收乙醇至無醇味。將浸膏分散于1 000 ml的熱水中，超聲處理使其成為均勻的混懸液。將混懸液冷卻至室溫后放置于4℃冰箱過夜，離心，棄去上清液，沉淀用熱水同法洗滌3次后再混懸于水中，先用石油醚500 ml萃取3次以除去葉綠素，再用500 ml氯仿萃取3次。氯仿萃取液減壓回收氯仿，得到樹豆脂溶性部位11 g，以SDE表示。

將SDE用質(zhì)量濃度為5 g·L－1的 CMCNa研磨，分別制成 10 g·L－1和 5 g·L－1的混懸液，滅菌備用。

1.2 試劑與儀器電子天平，賽西杰 DTT-B100;固體密度測定儀，DahoMeter DE-120M;酶聯(lián)免疫檢測儀，賽默飛世爾科技公司;對硝基苯(PNP)，天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20110102;對硝基苯酚磷酸鹽(pNPP)，Sigma，批號 20110818;甘油三酯(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TC)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒均購自長春匯力生物技術(shù)有限公司，批號分別為:2012008、2012032、2012032、2012045;鈣試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20120720。

1.3 動物和動物實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)所用db/db先天肥胖糖尿病小鼠、ob/ob先天肥胖高血糖小鼠，以及雜合子的db和ob小鼠，是通過從美國Jax Lab引入db小鼠和ob小鼠繁育對在SPF級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行繁育得到。實(shí)驗(yàn)得到廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的許可［實(shí)驗(yàn)許可證號:SYXY(粵)2008-001］，并嚴(yán)格按照動物實(shí)驗(yàn)有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.3.1 db/db小鼠的分組和治療 2月齡db/db小鼠20只［♀9，♂11，體質(zhì)量(30.0 ± 3.0)g］，隨機(jī)分為模型組6只(♀3，♂3)，SDE高劑量組7只(♀3，♂4)，SDE 低劑量組7只(♀3，♂4)。另選6只同源雜合子db小鼠(♀3，♂3)作為隨機(jī)對照組。按0.01 ml·g－1的灌胃體積計，SDE高劑量組(HSDE)100 mg·kg－1·d－1，SDE 低劑量組(L-SDE)50 mg·kg－1·d－1，模型組、隨機(jī)對照組灌服質(zhì)量濃度為5 g·L－1的 CMCNa。連續(xù)給藥8周。每隔3天測1次體重。

1.3.2 ob/ob小鼠的分組和治療 4月齡ob/ob小鼠21只［♀11，♂10，體質(zhì)量(58.0±2.6)g］，隨機(jī)分成3組，每組7只，分別為模型組(♀3，♂4)、SDE高劑量組(♀4，♂3)和 SDE低劑量組(♀4，♂3)。同時以6只(♀3，♂3)同源雜合子ob小鼠作為隨行對照組。治療方法與db/db小鼠相同。連續(xù)給藥8周，每隔3天測1次體重。

1.4 血清生化指標(biāo)檢測末次給藥后次日，小鼠禁食不禁水12 h，眼眶靜脈取血，離心分離血清。采用總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和鈣試劑盒檢測血清中各項指標(biāo);血清堿性磷酸酶(ALP)以pNPP偶氮法進(jìn)行測定。

1.5 血清ALP測定(pNPP偶氮法)測定方法參照包蕾等［13］的操作方法并進(jìn)行改良。具體方法如下:于96孔板中，每孔加入150 μl顯色底物溶液和5 μl樣品(3個復(fù)孔)，37 ℃避光放置0.5 h，然后加入50 μl終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于405 nm波長下測定OD值。樣品OD值在ALP標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出酶活性值(U·L－1)。

1.6 骨密度測定將采血后的小鼠頸椎脫臼處死。取兩側(cè)脛骨，60℃烘烤24 h后，采用固體密度測定儀測定骨密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較用方差分析，兩均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SDE對小鼠體重的影響實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時各組小鼠體重記錄見Tab 1?？煽闯觯瑹o論是db/db小鼠，還是ob/ob小鼠，其體重都明顯比其同齡的雜合子db和ob小鼠要重，且隨著年齡的增長這種情況更加嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)8周的SDE治療對db/db和ob/ob小鼠的體重未見明顯影響，模型組小鼠和治療組小鼠體重增長基本持平。

2.2 SDE對小鼠脛骨密度、血清堿性磷酸酶(ALP)和血鈣濃度的影響測得不同治療組db/db小鼠的脛骨密度、血清ALP水平和血鈣濃度數(shù)據(jù)見Tab 2、3。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時模型組db/db小鼠脛骨骨密度明顯低于同齡雜合子db小鼠，血清ALP水平明顯高于db小鼠，血鈣濃度明顯低于db小鼠。提示db/db小鼠有明顯的骨丟失。SDE高、低劑量治療組小鼠的骨密度值分別為(1.3352±0.0413)g·cm－3和(1.3178 ± 0.0180)g·cm－3，雖然未達(dá)到db小鼠的水平，但和模型組比較骨密度已經(jīng)有明顯的增加(P＜0.05)，同時治療組小鼠的血清ALP水平明顯下降到了db小鼠的水平(P＜0.01)。SDE治療組小鼠的血鈣濃度也有一定程度的上升，雖然和模型組比較這種差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)中SDE對db/db小鼠的治療作用具有一定的量效關(guān)系，高劑量的藥效略優(yōu)于低劑量，但組間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab 1 Effects of SDE treatment on body weight in db/db and ob/ob mice

Tab 2 Effects of SDE on tibial bone density in db/db mice

Tab 3 Effects of SDE on serum ALP and serum Ca2+in db/db mice

不同治療組ob/ob小鼠的脛骨密度、血清ALP水平和血鈣濃度數(shù)據(jù)見Tab 4、5。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時模型組ob/ob小鼠的骨密度略低于ob小鼠，但組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與此同時，ob/ob模型小鼠的血清ALP水平雖然和ob小鼠基本無差異，但其血鈣濃度卻明顯低于ob小鼠。提示ob/ob模型小鼠雖未表現(xiàn)出明顯的骨丟失，但骨代謝明顯異常。本實(shí)驗(yàn)中，兩個SDE劑量組ob/ob小鼠骨密度都較模型組小鼠大，血清ALP水平都較模型組有所下降。尤其是低劑量組小鼠，脛骨密度明顯增加到了(1.3251 ± 0.0665)g·cm－3(P ＜0.05)，血清 ALP水平則明顯下降到(142.83±13.82)U·L－1(P＜0.01)。SDE組小鼠的血鈣濃度較模型組有輕微上升，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 SDE對小鼠血脂的影響如Tab 6所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時模型組db/db小鼠和同齡雜合子db小鼠相比，TC、TG和LDL-C水平偏高，高血脂癥狀明顯。其HDL-C水平也明顯偏高。這些結(jié)果提示db/db小鼠血脂代謝明顯有異于同齡db小鼠。和模型組比較，兩個 SDE劑量組小鼠的 TC、TG、LDL-C和HDL-C水平有一定程度的下降，但這種下降并無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

Tab 7所示為ob/ob小鼠血脂相關(guān)數(shù)據(jù)。和隨行對照的ob小鼠相比，ob/ob模型小鼠具有超高水平的TC、TG和LDL-C，高血脂癥狀相當(dāng)明顯。其HDL-C水平也明顯高于ob小鼠。和模型組相比，高劑量SDE治療可明顯降低ob/ob小鼠的血清TC、TG和LDL-C。SDE治療組小鼠的HDL-C水平與模型組相比雖然略有下降，但仍維持在高水平，其下降并無統(tǒng)計學(xué)意義。SDE低劑量治療組取得類似結(jié)果。

3 討論

盡管有研究報道樹豆的脂溶性成分具有降脂減肥的作用，但在本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)SDE抑制db/db小鼠和ob/ob小鼠體重的增長。模型組小鼠和SDE治療組小鼠的體重增長趨勢基本一致(Tab 1)。分析原因，可能是部位的制備方法不同導(dǎo)致成分存在差異或是選用的動物模型不同所致。

堿性磷酸酶(ALP)是廣泛分布于人體各組織器官的一組同工酶，以骨、肝、腸黏膜中最為豐富，在排除懷孕、骨折愈合期以及兒童發(fā)育期等生理性原因后的血清ALP升高通常代表著嚴(yán)重的肝病如肝炎、肝癌，或骨骼疾病如骨瘤、骨質(zhì)疏松、佝僂病、軟骨病等［14］。

Tab 4 Effects of SDE on tibial bone density in ob/ob mice

Tab 5 Effects of SDE on serum ALP and serum Ca2+in ob/ob mice

Tab 6 Effects of SDE on blood lipid level in db/db mice

Tab 7 Effects of SDE on blood lipid level in ob/ob mice

本實(shí)驗(yàn)中，肥胖和糖尿病性的db/db小鼠具有比其同齡db小鼠更高的血清ALP(P＜0.01)和更低的血鈣濃度(P＜0.05)，提示其存在骨吸收強(qiáng)或骨形成弱的問題，這和測得其骨密度明顯降低(P＜0.01)的結(jié)果是一致的，說明肥胖型糖尿病確實(shí)造成了db/db小鼠嚴(yán)重的骨流失(Tab 2、3)，也說明選擇2月齡的db/db小鼠作為糖尿病骨質(zhì)疏松動物模型是合理的。我們發(fā)現(xiàn)，先天性肥胖的ob/ob小鼠比db/db小鼠具有更大的體重和更多的脂肪堆積，但無多飲多尿的糖尿病癥狀。在本實(shí)驗(yàn)中ob/ob小鼠表現(xiàn)為較同齡ob小鼠血鈣濃度明顯偏低(P＜0.05)、血清ALP水平基本一致和骨密度一定程度偏低(Tab 4、5)。說明ob/ob小鼠也存在一定程度的骨流失。采用SDE對db/db和ob/ob小鼠進(jìn)行治療的結(jié)果顯示，SDE可以明顯增加db/db小鼠和ob/ob小鼠的骨密度，降低血清ALP水平，提高血鈣濃度。我們的研究提示SDE對肥胖型糖尿病性骨質(zhì)疏松或肥胖致骨質(zhì)疏松的治療有積極意義。

我們還發(fā)現(xiàn)，盡管ob和 db小鼠都來源于C57BL，但試驗(yàn)中db小鼠和ob小鼠相比，其骨密度明顯偏高(P＜0.01)，血清ALP水平明顯偏低(P＜0.01)，血鈣濃度偏高。說明實(shí)驗(yàn)選用的ob小鼠雖然比同齡ob/ob小鼠骨密度高，但同樣也存在一定程度的骨丟失，也因此其血清ALP水平處于高水平。由于本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時ob和db小鼠的年齡分別為6個月和4個月，因此不排除年齡對ob小鼠的骨密度也存在一定影響。

在血脂代謝方面，通常情況下降低 TC、TG、LDL，提高HDL-C水平對諸多心血管疾病的產(chǎn)生具有預(yù)防的作用。HDL-C生理性的偏高對人體有益，而如果是病理性的，則提示機(jī)體出現(xiàn)了病變［15］。

肥胖小鼠由于長期處于高血脂狀態(tài)，肝臟會出現(xiàn)一定程度的脂肪堆積導(dǎo)致脂肪肝，而糖尿病人由于長期的高血糖也會導(dǎo)致一定程度的肝損傷［16］。這可能是試驗(yàn)中db/db模型小鼠和ob/ob模型小鼠的HDL-C水平明顯高于隨機(jī)對照的db和ob小鼠的原因。所以我們認(rèn)為降低db/db糖尿病小鼠和ob/ob肥胖小鼠的HDL-C水平也是脂代謝紊亂得到改善的表現(xiàn)之一。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出SDE能夠明顯降低db/db糖尿病小鼠、ob/ob肥胖小鼠的TC、TG、LDLC水平，同時一定程度地降低HDL-C水平(Tab 6、7)，說明SDE在改善肥胖、高血糖小鼠的脂代謝方面有明確的療效。

通過上述結(jié)果，我們可以確定:(1)SDE能夠增加db/db糖尿病小鼠、ob/ob肥胖小鼠的骨密度，并能夠降低db/db糖尿病小鼠、ob/ob肥胖小鼠的血清ALP水平;(2)SDE能夠優(yōu)化db/db糖尿病小鼠、ob/ob肥胖小鼠的血脂代謝。因此我們認(rèn)為SDE對糖尿病性骨質(zhì)疏松和肥胖致骨質(zhì)疏松有一定的治療效果，而且SDE能夠改善血脂代謝，在一定程度上又能夠避免糖尿病慢性并發(fā)癥如微血管病變、脂肪肝的出現(xiàn)，防止肥胖—糖尿病—糖尿病慢性并發(fā)癥—骨質(zhì)疏松的疾病轉(zhuǎn)變。SDE對糖尿病性以及肥胖骨質(zhì)疏松的治療作用和改善血脂代謝的機(jī)制我們將做進(jìn)一步的研究。

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