衣霉素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞增殖及凋亡的影響

徐錦程，夏 飛，張 配，浦龍健，黃瑩瑩，李 陽(yáng)，張媛媛，劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院1.第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠 233004;2.藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠 233030)

口腔鱗癌(oral squamous carcinoma，OSCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤，占全身腫瘤的3%。每年全球有50萬(wàn)新發(fā)病例，患者的5年生存率僅50%［1］?；熓强谇话┲匾妮o助治療方法之一，但是當(dāng)前化療面臨的主要問(wèn)題是癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性下降，導(dǎo)致多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生，使癌細(xì)胞產(chǎn)生具有同時(shí)抵抗結(jié)構(gòu)及功能作用各不相同的廣譜化療藥物的能力［2］。因此，研究其耐藥機(jī)制、克服化療耐藥，發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一［3］。本文研究了糖基化抑制劑TM對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并聯(lián)合常用治療口腔癌藥物奧沙利鉑，檢測(cè)TM增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞的凋亡作用，并對(duì)其初步機(jī)制進(jìn)行探討，為口腔癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人口腔上皮癌細(xì)胞株KB細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)得。

1.1.2 主要試劑 Minimum Essential Medium(MEM)培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素:美國(guó)Invitrogen公司。胎牛血清:杭州四季青公司。奧沙利鉑:批號(hào):H20093167，齊魯制藥有限公司產(chǎn)品。噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT):Sigma進(jìn)口分裝。Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒:碧云天公司。兔抗人Glucose regulated protein 78抗體，鼠抗人 β-actin:Santa Cruz公司。兔抗人Caspase-3抗體:Abcam公司。兔抗人 Caspase-12抗體:碧云天公司。WBKLS0500底物顯色試劑為Millipore產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 口腔上皮癌細(xì)胞KB采用MEM培養(yǎng)液，含10%滅活胎牛血清，2.0 g·L－1Hepes，2.0 g·L－1碳酸氫鈉，1 × 105IU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 單層培養(yǎng)的KB細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后配成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，密度 7 ×104個(gè)/孔，每孔 100 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加入含10%胎牛血清新鮮培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)設(shè)調(diào)零組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。結(jié)束培養(yǎng)4 h前，每孔加入15 μl MTT(5 mg·L－1溶液，孵育，終止培養(yǎng)后加入三聯(lián)液100 μl過(guò)夜，振蕩，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)吸光度值A(chǔ)，按公式，存活率/%=(藥物組A值－調(diào)零組A值)/(對(duì)照組A－調(diào)零組A值)×100%，計(jì)算癌細(xì)胞存活率。

1.2.3 集落克隆形成實(shí)驗(yàn) 接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，密度1×104個(gè)/孔，24 h后吸棄培養(yǎng)液，分別加 0.25 μmol·L－1衣霉素、0.125 μmol·L－1奧沙利鉑以及兩者合用處理細(xì)胞，每孔加入含10%血清新鮮MEM培養(yǎng)液2 ml，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，5 d后終止培養(yǎng)，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌1遍，體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛 －20℃固定10 min，棄固定液，加結(jié)晶紫染色液室溫染色10 min，去離子水緩慢洗去染色液，室溫下干燥，拍照。

1.2.4 PI染色檢測(cè)凋亡 將人口腔癌KB細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，密度1×105個(gè)/孔，分別加入衣霉素、奧沙利鉑以及二者合用，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后獲取細(xì)胞，PBS洗滌2遍，加入體積分?jǐn)?shù)為0.70的冷乙醇固定，4℃過(guò)夜，PBS洗去固定液，PI染液混勻后，避光2 h，用流式細(xì)胞儀作流式細(xì)胞分析，檢測(cè)具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Caspase-3活性檢測(cè) 接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，密度1×106個(gè)/孔，分別加入衣霉素、奧沙利鉑以及二者合用，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后獲取細(xì)胞。將細(xì)胞重新懸浮于50 μl冷細(xì)胞裂解緩沖液中，冰上放置10 min。4℃下12 000 r·min－110 min以去除細(xì)胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移至另一微離心管中，置于冰上。向每組加入50 μl的2×反應(yīng)緩沖液/DTT混合液。向每管加入5 μl的1 mmol·L－1Caspase-3底物。水浴37℃孵育1 h。在405 nm波長(zhǎng)下讀取OD值。根據(jù)試劑盒說(shuō)明所得斜率值，按Caspase-3活性單位=(試驗(yàn)組OD－對(duì)照組OD)/斜率，計(jì)算Caspase-3活性單位。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人口腔癌KB細(xì)胞，按每孔8×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板上，培養(yǎng)24 h后加入藥物。加藥培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min蛋白變性，每組各取30 μg總蛋白樣品，采用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，5% 脫脂牛奶封閉過(guò)夜，一抗(1∶500稀釋)與轉(zhuǎn)移膜反應(yīng)2 h，TBST洗膜5 min×3次。二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次，PBS洗膜1次;Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate試劑盒用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 衣霉素增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞增殖的抑制作用實(shí)驗(yàn)中用不同濃度的衣霉素、奧沙利鉑以及聯(lián)合使用，能明顯抑制口腔癌細(xì)胞KB生長(zhǎng)。0.125 μmol·L－1衣霉素作用于人口腔癌 KB細(xì)胞 24、48、72 h存活率為 90.37%、89.44%、88.91%;1 μmol·L－1奧沙利鉑作用于人口腔癌 KB細(xì)胞24、48、72 h存活率分別為62.36%、47.54%、40.47%。0.125 μmol·L－1衣霉素與 1 μmol·L－1奧沙利鉑誘導(dǎo)人口腔癌KB細(xì)胞24、48、72 h的存活率為50.78%、37.77%、23.24%，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)Fig 1。

2.2 衣霉素增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞集落克隆形成的抑制作用根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用低于 IC50的 0.25 μmol·L－1衣霉素、0.125 μmol·L－1奧沙利鉑以及二者聯(lián)合刺激細(xì)胞，使用集落克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞增殖抑制作用的影響。結(jié)果表明，衣霉素在低濃度即可增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞的集落克隆形成的抑制(Fig 2)。

Fig 1 Effects of drugs on viability of KB cells

Fig 2 TM increased inhibitory effect of L-OPH on colony formation of KB cells

2.3 衣霉素增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)人口腔癌KB細(xì)胞凋亡的作用不同藥物對(duì)口腔癌KB細(xì)胞株作用48 h時(shí)的凋亡率比較:0.5 μmol·L－1衣霉素刺激 48 h，誘導(dǎo)人口腔癌 KB細(xì)胞的凋亡率為8.3%。1 μmol·L－1奧沙利鉑誘導(dǎo)人口腔癌KB細(xì)胞48 h的凋亡率為 24.6%。0.5 μmol·L－1衣霉素對(duì) 1 μmol·L－1奧沙利鉑誘導(dǎo)人口腔癌KB細(xì)胞48 h的凋亡率為50.3%，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，F(xiàn)ig 3)。上述結(jié)果表明，衣霉素可以增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)的口腔癌細(xì)胞凋亡。

2.4 衣霉素增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔癌KB細(xì)胞的Caspase-3激活作用為觀察衣霉素及其聯(lián)合奧沙利鉑作用下對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞Caspase-3活性的影響，根據(jù)Caspase-3活性試劑盒檢測(cè)藥物處理前后Caspase-3活性的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:衣霉素刺激細(xì)胞后，并未出現(xiàn)Caspase-3的激活，但衣霉素對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔癌KB細(xì)胞Caspase-3激活有明顯的增強(qiáng)作用(P＜0.01，F(xiàn)ig 4)。

2.5 衣霉素對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)的人口腔癌KB細(xì)胞的GRP-78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響人口腔癌KB細(xì)胞給予不同的刺激后收集蛋白，Western blot檢測(cè)GRP-78、Caspase-12 和Caspase-3蛋白的表達(dá)，從Fig5可以看出，衣霉素可誘導(dǎo)細(xì)胞GRP-78的表達(dá)，衣霉素聯(lián)合奧沙利鉑處理KB細(xì)胞后，可誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的GRP-78的表達(dá)。同時(shí)可以看到特異性定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白Caspase-12的表達(dá)，聯(lián)合用藥組高于單獨(dú)用藥組，蛋白Caspase-3的表達(dá)聯(lián)合用藥組高于單獨(dú)用藥組(Fig 5)。

Fig 5 Expressions of GRP78 Caspase-12 and Caspase-3 in KB cells

3 討論

腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因，因此抑制腫瘤增殖和促進(jìn)腫瘤凋亡是藥物治療腫瘤的關(guān)鍵。然而臨床上出現(xiàn)對(duì)抗腫瘤藥物耐受現(xiàn)象，常導(dǎo)致化療失?。?，4－5］。因此尋求低劑量的藥物以及降低藥物對(duì)人體的副作用成為我們關(guān)注重點(diǎn)。糖基化抑制劑衣霉素的抗腫瘤作用被廣泛關(guān)注，從培養(yǎng)細(xì)胞到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以及臨床實(shí)驗(yàn)不斷的開展，并針對(duì)單獨(dú)抗腫瘤到與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用方面進(jìn)行探索［6－7］。本次研究觀察了衣霉素增強(qiáng)奧沙利鉑抗口腔癌的作用。從上述的結(jié)果可以看出，衣霉素可增加奧沙利鉑對(duì)口腔癌細(xì)胞KB的增殖抑制作用，增強(qiáng)其誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡;衣霉素還可增高奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞KB的GRP-78表達(dá)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并增強(qiáng)Caspase-3蛋白的表達(dá)。

目前，越來(lái)越多的研究提示，細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下(鈣離子平衡失調(diào)、缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏等)激活未折疊蛋白反應(yīng)，通過(guò)IRE1、ATF6、PERK起始的3條信號(hào)通路，使得多基因轉(zhuǎn)錄激活，翻譯普遍減少而選擇性翻譯特性的蛋白質(zhì)，促進(jìn)蛋白的正確翻譯和折疊，來(lái)適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，因此未折疊蛋白反應(yīng)被認(rèn)為是細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制［8－10］。但是有大量報(bào)道提示應(yīng)激過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂不能恢復(fù)反而可以通過(guò)激活COHP/CADD153路徑、Caspase路徑等促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的中心調(diào)節(jié)者，由于其在蛋白折疊、聚集、促進(jìn)非折疊蛋白降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子連接和控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感受器激活等過(guò)程中具有重要的作用，因此GRP78的誘導(dǎo)被廣泛用作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR啟動(dòng)的生物標(biāo)記［12］。無(wú)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)GRP78分別和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的應(yīng)激感受蛋白IRE1α、ATF6、PERK結(jié)合處于無(wú)活性狀態(tài)。但當(dāng)鈣離子平衡失調(diào)、缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)，未折疊蛋白堆積使得GRP78與應(yīng)激感受蛋白分離，因此GRP78高表達(dá)是口腔癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的化療耐受的原因之一［12－13］。本研究中，口腔癌細(xì)胞GRP78表達(dá)量很少，然而在衣霉素刺激24 h后GRP78表達(dá)量增加。說(shuō)明衣霉素上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78的表達(dá)，啟動(dòng)UPR反應(yīng)。而當(dāng)用衣霉素和奧沙利鉑聯(lián)合刺激24 h后GRP78表達(dá)量增加，這提示我們過(guò)強(qiáng)的應(yīng)激有可能超過(guò)UPR對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用的能力，從而激活了下游Caspase的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

Caspase-12定位于ER膜上，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子，以前體形式存在當(dāng)沒(méi)有發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，Caspase-12的表達(dá)量很少，僅在ERS刺激下活化，發(fā)生自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)的移位，表達(dá)量增加，激活的Caspase-12可剪切細(xì)胞凋亡途徑中公共下游效應(yīng)分子 Caspase-3，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14－15］。本研究中口腔癌細(xì)胞中經(jīng)衣霉素、奧沙利鉑以及二者合用刺激24 h后Caspase-12的表達(dá)增加，并且剪切Pro-caspase-3，使得 Caspase-3的表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，對(duì)于Caspase-3活性的檢測(cè)也同樣提示:合用組的Caspase-3活性明顯高于單用組及對(duì)照組。這些結(jié)果都說(shuō)明了過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)促使UPR從細(xì)胞保護(hù)轉(zhuǎn)變成促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而這一凋亡的機(jī)制是通過(guò)激活一系列Caspase。當(dāng)然，關(guān)于ER應(yīng)激的不同程度對(duì)腫瘤細(xì)胞存活的影響以及通過(guò)何種路徑激發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡尚需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行說(shuō)明。這也是本研究需要進(jìn)一步深入探討的問(wèn)題，而本次研究恰為深入認(rèn)識(shí)ER應(yīng)激提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

總之，本研究證實(shí)了糖基化抑制劑衣霉素對(duì)人口腔癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且可以明顯增加臨床常用治療口腔癌細(xì)胞的藥物誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞的凋亡作用。其機(jī)制可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多ER應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)Caspase-3活性而發(fā)揮作用。

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