• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    葡萄籽中多酚類化合物對(duì)口腔致病菌的抑制作用

    2013-02-19 06:52:46吳大茹尤曉娟陳莉娜
    關(guān)鍵詞:葡萄籽牙周病致病菌

    張 卉, 吳大茹, 尤曉娟, 陳莉娜*

    (1.西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,陜西 西安 710061;2.美國伊利諾伊大學(xué) 芝加哥分校牙科醫(yī)學(xué)院,芝加哥60612)

    葡萄籽提取物(Grape seed extract,GSE)是目前風(fēng)靡世界的一種食品添加劑和保健品。在美國、日本和歐洲,GSE成為人們?nèi)粘I钪凶畛J褂玫奶烊槐=∑罚悄壳懊绹烊恢参锾崛∥?0大暢銷品種之一。在日本的年銷量達(dá)到每年100 000 kg[1],具有巨大的市場(chǎng)潛力和開發(fā)價(jià)值。GSE的最大功用在于其中富含多酚類化合物,其中花青素類是目前為止發(fā)現(xiàn)的最高效的氧自由基清除劑,具有極強(qiáng)的抗氧化作用,其抗氧化活性為維生素E的50倍、維生素C的20倍,它能有效清除人體內(nèi)多余的自由基,具有超強(qiáng)的延緩衰老和增強(qiáng)免疫力的作用,被廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病、癌癥、眼科疾病以及化妝品等領(lǐng)域[2-6]。然而對(duì)于其中多酚類化合物(包括原花青素以及其它多酚)的抗菌作用的研究報(bào)道較少,特別是應(yīng)用于口腔健康領(lǐng)域的研究并不多見。但是已有研究表明,GSE中的多酚類成分具有抑制口腔致病菌的作用,法國的Bonnaure-Mallet Martine等發(fā)明了以原花青素低聚體或單體為活性成分(≥1%)治療牙周病的制劑[7],并獲得了專利保護(hù)。因此,在美國伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校牙科醫(yī)學(xué)院的資助下,作者進(jìn)行了GSE中多酚類化合物對(duì)口腔致病菌的抑制作用的研究。

    1 材料與方法

    1.1 葡萄籽提取物

    實(shí)驗(yàn)中使用的葡萄籽提取物來源于美國Polyphenolics公司(Madera,CA 93639,USA)。

    1.2 微生物及培養(yǎng)條件

    實(shí)驗(yàn)中使用的口腔致病菌包括致齲病菌變異鏈球菌 Streptococcus mutans(ATCC 10449)和戈登鏈球菌(Streptococcus gordonii challis)以及牙周病菌具 核 梭 桿 菌 Fusobacterium nucleatum(ATCC 10953),這些菌種均保存于美國伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校牙科醫(yī)學(xué)院的菌種庫中。實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基包括腦心浸液培養(yǎng)基(Difco,Sparks,MD) 和厭氧培 養(yǎng) 基 (Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England)。培養(yǎng)條件為37℃,于普通培養(yǎng)箱(對(duì)于變異鏈球菌和戈登鏈球菌)或厭氧培養(yǎng)箱(對(duì)于具核梭桿菌)中培育 24~48 h。

    1.3 試劑

    實(shí)驗(yàn)中使用的色譜填料有:大孔樹脂HP-20,購 于 Supelco 公 司 (Bellefonte,PA,USA);Sephadex LH-20,購于GE Healthcare公司。其它化學(xué)試劑均購于 Fisher公司(Fair Lawn,NJ,USA)。

    1.4 儀器

    光密度測(cè)試使用Power Wave 200微板掃描分光光度儀 (Bio-Tek Instruments Inc.,Winooski,VT,USA)。

    1.5 最小抑制濃度法(MIC Assay)

    在96孔微量滴定板中加入待測(cè)試的樣品溶液和相應(yīng)的培養(yǎng)基。取相應(yīng)的測(cè)試菌株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)(12 h)后,將培養(yǎng)液離心(10 000 r/min,10 min),吸取上層清液并用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 6.8)洗滌兩次,而后將菌落混懸于PBS中。測(cè)試菌落混懸液的光密度值(OD),并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的稀釋,將混懸液加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的96孔微量滴定板中,使其終濃度達(dá)到5×105(變異鏈球菌和戈登鏈球菌)或5×106(具核梭桿菌)CFU/mL。陰性對(duì)照組加入與測(cè)試樣品溶液等體積的生理鹽水,陽性對(duì)照組加入葡萄糖酸洗必泰溶液 (chlorhexidine gluconate,CHX),其對(duì)于3種細(xì)菌的MIC值分別為1.25 μg/mL(變異鏈球菌)、2.5 μg/mL(戈登鏈球菌)和 2.5 μg/mL(具核梭桿菌)。所有的培養(yǎng)平板均置于37℃相應(yīng)的培養(yǎng)箱(普通培養(yǎng)箱用于培養(yǎng)變異鏈球菌和戈登鏈球菌,厭氧培養(yǎng)箱用于培養(yǎng)具核梭桿菌)中,培養(yǎng)24~48h。而后將培養(yǎng)平板置于光密度測(cè)試儀上讀取培養(yǎng)液的OD值。通過比較OD值的大小判斷微生物的生長情況,OD越大說明微生物生長越多,從而推測(cè)被測(cè)組分的最小抑制濃度。

    1.6 GSE的分離

    將60 g葡萄籽提取物溶解于300 mL蒸餾水中,加樣于大孔吸附樹脂柱,分別以水、20%,40%,60%,80%系列體積分?jǐn)?shù)的甲醇/水和純甲醇依次洗脫,分為6個(gè)組分,分別記為PA-1~PA-6。對(duì)這些組分的MIC進(jìn)行測(cè)試后發(fā)現(xiàn)PA-1的最小抑制濃度較其它各組分為低,因而對(duì)其采用Sephadex LH-20柱色譜進(jìn)行了進(jìn)一步的分離,分別以10%,15%,20%,30%,50%,80%,90%系列體積分?jǐn)?shù)甲醇/水和純甲醇進(jìn)行洗脫,獲得13個(gè)組分,分別標(biāo)記為PA-1-1~PA-1-13。繼續(xù)采用MIC進(jìn)行活性追蹤,對(duì)PA-1-7采用硅膠柱色譜分離,以V(甲苯)∶V(丙酮)∶V(乙酸)=5∶1∶0.1 和 3∶1∶0.1 作為流動(dòng)相,獲得化合物1(沒食子酸);對(duì)PA-1-10采用硅膠柱色譜分離,以 V(甲苯)∶V(丙酮)∶V(乙酸)=3∶1∶0.1 和 3∶3∶0.1作為流動(dòng)相,獲得化合物3(原兒茶酸);對(duì)PA-1-11采用Sephadex LH-20柱色譜進(jìn)行分離,以體積分?jǐn)?shù)75%、80%甲醇/水及純甲醇為流動(dòng)相,獲得化合物2(鄰苯三酚);對(duì)PA-1-12采用硅膠柱色譜分離,以V(甲苯)∶V(丙酮)∶V(乙酸)=3∶1∶0.1,3∶3∶0.1,3∶5∶0.1和 3∶7∶0.1作為流動(dòng)相,獲得化合物 4(表兒茶素)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 活性追蹤分離獲得的4種多酚類化合物結(jié)構(gòu)確證

    化合物 1:白色針晶(丙酮),1H NMR (360 MHz,DMSO-d6) δH 6.95 (2H,s,H-2 及 H-6);13C NMR(80 MHz,DMSO-d6)δc109.6 (C-2 及 C-6),121.4(C-1),138.9(C-4),146.4(C-3 及 C-5),168.5(C-7);HR-ESIMS:m/z 169.0139 [M-H]-(C7H6O5,calcd 169.014 2)。通過波譜解析并與文獻(xiàn)對(duì)比[8],確定其為沒食子酸。

    化合物 2:白色針晶(丙酮),1H NMR(360 MHz,DMSO-d6) δH6.27 (2H,d,J=7.2 Hz,H-4 及 H-6),6.45(1H,dd,J=8.5,8.5 Hz,H-5);13C NMR(80 MHz,DMSO-d6) δc108.0 (C-4 及 C-6),119.4 (C-5),134.0 (C-2),147.2 (C-1 及 C-3);HR-ESIMS:m/z 125.0238[M-H]-(C6H6O3,calcd 125.022 6)。 通過波譜解析并與文獻(xiàn)對(duì)比[8],確定其為鄰苯三酚。

    化合物 3:白色針晶(丙酮),1H NMR(360 MHz,acetone-d6) δH6.89 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5),7.47(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6),7.52 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2);13C NMR (80 MHz,acetone-d6) δc115.3 (C-5),117.1(C-2),123.2(C-6),124.5(C-1),141.6(C-3),146.5 (C-4),159.7 (C-7);HR-ESIMS:m/z 153.0185[M-H]-(C7H6O4,calcd 153.017 2)。 通過波譜解析并與文獻(xiàn)對(duì)比[8],確定其為原兒茶酸。

    化合物 4:白色粉末(甲醇),1H NMR(360 MHz,acetone-d6) δH2.49 (1H,dd,J=16.1,8.7 Hz,H-4axi),2.89 (1H,dd,J=16.1,5.6 Hz,H-4eq),3.96(1H,m,H-3),4.51 (1H,d,J=7.9 Hz,H-2),5.85(1H,d,J=2.3 Hz,H-8),6.00(1H,d,J=3.2 Hz,H-6),6.72(1H,dd,J=8.1,1.9 Hz,H-6’),6.78(1H,d,J=8.1 Hz,H-5’),6.88 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2’);13CNMR (80 MHz,acetone-d6) δc27.8 (C-4),67.2(C-3),81.6(C-2),94.1(C-8),95.0(C-6),99.4(C-4a),114.2(C-2’),114.5(C-5’),118.8(C-6’),130.8(C-1’),144.6(C-3’),144.7(C-4’),155.7(C-8a),156.2(C-5),156.7(C-7);ESIMS m/z 288[M-H]-。通過波譜解析并與文獻(xiàn)對(duì)比[9],確定其為表兒茶素。

    如圖1所示。

    圖1 葡萄籽提取物經(jīng)活性追蹤分離獲得的4種多酚類化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemicalstructures of the 4 polyphenol compounds isolated from GSE with bioactivity guide

    2.2 葡萄籽提取物不同極性部分的抑菌活性

    葡萄籽提取物經(jīng)大孔吸附樹脂柱分離后,水洗部分(PA-1)對(duì)所測(cè)試的3個(gè)菌種的最小抑制質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/mL(變異鏈球菌)、2 mg/mL(戈登鏈球菌)和0.25 mg/mL(具核鏈球菌),相對(duì)于其它醇洗部分具有較好的抑菌活性(見表1)。由此可以推測(cè)葡萄籽提取物中的極性較大,在大孔吸附樹脂柱上容易被水洗脫的化合物(初步推斷為多酚類化合物)具有良好的抑制致齲病菌和牙周病菌的作用。

    2.3 大極性部分中不同分子量部分的抑菌活性

    將PA-1部分于葡聚糖凝膠色譜柱上進(jìn)行進(jìn)一步的分離后,對(duì)所獲得的組分進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定。結(jié)果表明,洗脫流分PA-1-11對(duì)所測(cè)試的3個(gè)菌種具有較好的抑制活性,最小抑制質(zhì)量濃度分別為 0.125 mg/mL(變異鏈球菌)、0.25 mg/mL(戈登鏈球菌)和 0.031 25 mg/mL(具核梭桿菌)(見表 2)。 由于葡聚糖凝膠色譜柱主要是依照分子量大小進(jìn)行分離的,因此可以推測(cè)產(chǎn)生較好抑菌效果的并非具有較大分子量的花青素類化合物,而是一些小分子多酚類化合物,這也與法國學(xué)者的研究結(jié)果相一致[7]。

    表1 PA-1~PA-6對(duì)3種口腔致病菌的最小抑制濃度 mg/mLTable 1 MIC of fraction PA-1 to PA-6 against 3 kinds of periodontitis or cariogenic bacterial

    表2 PA-1-1~PA-1-13對(duì)三種口腔致病菌的最小抑制濃度 mg/mLTable 2 MIC of fraction PA-1-1 to PA-1-13 against 3 kinds of periodontitis or cariogenic bacterial

    2.4 幾種小分子多酚類化合物的抑菌活性

    根據(jù)上述活性測(cè)試的結(jié)果,對(duì)抑菌活性較強(qiáng)的PA-1-7、PA-1-10、PA-1-11 和 PA-1-12 進(jìn)行了進(jìn)一步硅膠柱色譜的分離,獲得化合物1~4,并測(cè)定了它們對(duì)致齲病菌和牙周病菌的最小抑制質(zhì)量濃度(表3)。由結(jié)果可知,化合物2,即鄰苯三酚,對(duì)致齲病菌和牙周病菌的抑制作用最強(qiáng),其次是化合物1(沒食子酸)。這兩個(gè)化合物均含有3個(gè)鄰位酚羥基,提示這一結(jié)構(gòu)對(duì)于口腔致病菌的抑制作用最強(qiáng),而羧基的引入(化合物1)不僅沒有增加抑菌活性,反而有所減弱?;衔?僅含有2個(gè)鄰位酚羥基,并具有羧基,其抑菌作用大大降低。化合物4(表兒茶素)作為花青素類化合物的基本結(jié)構(gòu)單元,對(duì)牙周病菌具有一定的抑制活性,但對(duì)致齲病菌作用較弱,進(jìn)一步證實(shí)了花青素類成分抗菌活性較差的推斷。

    表3 化合物1~4對(duì)三種口腔致病菌的最小抑制濃度Table 3 MIC (mg/mL) of comp.1-4 against 3 kinds of periodontitis or cariogenic bacterial mg/mL

    3 結(jié)語

    綜上所述,可以推斷葡萄籽提取物對(duì)于保護(hù)口腔健康是非常有利的,而其中能夠抑制致齲病菌和牙周病菌的化學(xué)成分并非抗氧化活性較好的且具有較高聚合度的花青素類化合物,而是其低聚物、單體或分子量更小的多酚類化合物,其中以含有鄰苯三酚結(jié)構(gòu)的化合物抑菌活性最佳,當(dāng)酚羥基減少或結(jié)構(gòu)中增加羧基時(shí),抑菌活性降低,其中酚羥基數(shù)目的影響大于羧基的影響。

    [1]Market view.Antioxidant foodstuffs[J].Nikkei Bio-business,2001(11):129-130.

    [2]Ammar E M,Said S A,El-Damarawy S L,et al.Cardioprotective effect of grape-seed proanthocyanidins on doxorubicin-induced cardiac toxicity in rats[J].Pharm Biol,2013,51:339-344.

    [3]Gollucke A P B,Aguiar O,Barbisan L F,et al.Use of grape polyphenols against carcinogenesis:putative molecular mechanisms of action using in vitro and in vivo test systems[J].J Med Food,2013,16:199-205.

    [4]Yamakoshi J,Saito M,Kataoka S,et al.Procyanidin-rich extract from grape seeds prevents cataract formation in hereditary cataractous (ICR/f) rats[J].J Agric Food Chem,2002,50:4983-4988.

    [5]吳嘉慧,袁春龍,宋洋波.葡萄籽功能性成分及其應(yīng)用[J].日用化學(xué)工業(yè),2011,41:216-228.WU Jia-hui,YUAN Chun-long,SONG Yang-bo.Functional components of grape seed and its application[J].China Surfactant Detergent&Cosmetics,2011,41:216-228.(in Chinese)

    [6]彭亮,傅偉忠,姚思宇,等.葡萄籽粉對(duì)自然衰老大鼠的抗氧化作用研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2012,22:2376-2378.PENG Liang,F(xiàn)U Wei-zhong,YAO Si-yu,et al.Study on the antioxidant effect of grape seed powder in natural aging rats[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2012,22:2376-2378.(in Chinese)

    [7]Jolivet-Gougeon A,Sixou Jean-Louis,Tamanai-Shacoori Z,et al.Antimicrobial treatment of capnocytophaga infections[J].International Journal of Antimicrobial Agents,2007,29:367-73.

    [8]Haddock E A,Gupta R K,Al-Shafi S M K,et al.The metabolism of gallic acid and hexahydroxydiphenic acid in plants:biogenetic and molecular taxonomic considerations[J].Phytochemistry,1982(5):1049-1062.

    [9]Richard F C,Goupy P M,Nicolas J J,et al.Cysteine as an inhibitor of enzymatic browning 1 Isolation and characterization of addition-compounds formed during oxidation of phenolics by apple polyphenol oxidase[J].J Agric Food Chem,1991,39:841-847.

    猜你喜歡
    葡萄籽牙周病致病菌
    吃葡萄籽可以防癌抗衰老嗎?
    葡萄籽在日化用品中的應(yīng)用
    SSEL結(jié)合多重PCR同時(shí)快速檢測(cè)生菜中4種食源性致病菌
    胃食管反流病與牙周病的相關(guān)性
    葡萄籽多酚泡騰顆粒制備工藝及含量測(cè)定
    中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:08:06
    食品中致病菌快速檢測(cè)方法的探討
    自鎖托槽矯治器在成人牙周病中的應(yīng)用
    食管疾病(2015年3期)2015-12-05 01:45:10
    吃葡萄要不要吐籽?
    恒久性修復(fù)體在牙周病治療中的應(yīng)用
    金屬烤瓷橋在慢性牙周病治療中的探討
    新晃| 娄烦县| 镇安县| 瑞安市| 遂川县| 乌鲁木齐县| 南澳县| 万盛区| 梁河县| 怀安县| 寿宁县| 平度市| 四会市| 华宁县| 洛扎县| 万源市| 剑阁县| 绥德县| 白银市| 彭阳县| 腾冲县| 涟水县| 永修县| 西乌珠穆沁旗| 土默特左旗| 天门市| 杨浦区| 如皋市| 太原市| 德令哈市| 武邑县| 宜兰市| 金寨县| 望都县| 仁布县| 濉溪县| 马公市| 中阳县| 吴旗县| 临邑县| 兰坪|