丙烯酰胺樣品前處理及其檢測方法研究進(jìn)展

孫秀蘭， 紀(jì) 劍， 安 璐， 張銀志

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

丙烯酰胺 （acrylamide），是一種有毒的無色、無味透明固體結(jié)晶，沸點(diǎn)為125℃，熔點(diǎn)為84～85℃，室溫下穩(wěn)定，熔融或暴露在紫外光下以及氧化條件下易發(fā)生聚合反應(yīng)產(chǎn)生聚丙烯酰胺。動物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)證明，丙烯酰胺可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)改變和癌癥。其主要源于薯?xiàng)l薯片，炸透的薯片中丙烯酰胺含量高達(dá)12 800 μg/kg。JECFA根據(jù)各國丙烯酰胺攝入量，認(rèn)為人平均攝入量約 0.001 mg/（kg·d）[1]。 且我國將食品中丙烯酰胺的檢驗(yàn)列為“十五”國家重大科技專項(xiàng)“食品安全關(guān)鍵技術(shù)”課題，衛(wèi)生部食品安全計(jì)劃也將食品中丙烯酰胺檢測方法的建立和我國食品丙烯酰胺分布調(diào)查作為一個(gè)重要內(nèi)容。目前食品中丙烯酰胺的測定方法主要采用色譜法，尤其是色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)大大提高了測定的靈敏度和準(zhǔn)確度，已成為國際關(guān)注的檢測技術(shù)。作者就近年來國內(nèi)外應(yīng)用較多、有良好前景的樣品前處理及檢測方法作一簡要綜述。

1 丙烯酰胺樣品前處理技術(shù)

食品中丙烯酰胺的分析通常需經(jīng)過樣品提取、純化富集、分離檢測等步驟，樣品前處理是核心，它對保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性、提高檢測效率具有重要的影響，主要包括提取、衍生和凈化等步驟。提取指使用適當(dāng)溶劑將待測物連同樣品基質(zhì)從固態(tài)樣品中轉(zhuǎn)移至易于凈化和分析的液態(tài)；凈化指將待測物與提取液中的干擾物質(zhì)分離，在有些方法中提取和凈化一步完成，而對于某些復(fù)雜樣品，提取后往往還需凈化才能達(dá)到待測物與干擾雜質(zhì)分離。另外，一些檢測方法需要將樣品衍生化，從而改善丙烯酰胺的分離度和靈敏度。

1.1 液-液萃取

水是目前應(yīng)用最廣泛的萃取溶劑，因?yàn)楸０吩谒械娜芙舛茸畲?，對于大多?shù)食品樣品萃取完全。丙烯酰胺在酸性溶液中更加穩(wěn)定，美國FDA建議用含體積分?jǐn)?shù)0.1%的蟻酸水溶液萃取樣品[2]。而且為了追求樣品的高回收率和避免樣品前處理過程中乳化現(xiàn)象產(chǎn)生，經(jīng)常在萃取前加入一定量的NaCl水溶液，以達(dá)到破乳的目的[3]。近年來加速溶劑萃?。ˋSE）的方法被廣泛地應(yīng)用于復(fù)雜樣品的前處理過程，其突出優(yōu)點(diǎn)是溶劑用量少、快速、基體影響小、萃取效率高、選擇性好[4]。

王海波[5]以10 mmol/L甲酸溶液與乙腈體積比7∶3混合為提取溶液，精密稱取待測丙烯酰胺樣品5 g，加提取溶液50 mL使充分溶解混勻，室溫30℃下振蕩1 h后取出靜置10 min以沉淀不溶物質(zhì)。取上清液 5 mL，經(jīng)過 0.22 μm尼龍濾膜和 On Guard RP柱過濾，濾液直接上機(jī)分析。對于脂肪含量高的樣品，可采用有機(jī)溶劑萃取。

加速溶劑萃取技術(shù) （ASE）是一種在提高溫度（50～200 ℃）和壓力（10.3～20.6 MPa）的條件下，利用有機(jī)溶劑萃取固體或半固體的樣品前處理方法。其優(yōu)點(diǎn)是溶劑用量少、快速、基體影響小、選擇性好、萃取效率高。Cavalli[6]等人以水作為提取溶劑，采用加速溶劑萃取技術(shù)得到MS的檢測限為10～1 000 μg/mL。同時(shí)瑞士公共安全部門也提出了采用ASE提取食品中的丙烯酰胺的方法。

1.2 固相微萃取

固相微萃?。⊿PME）是集采集、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的樣品處理新技術(shù)，可與GC-MS、HPLCMS等聯(lián)用[7]。近年來在食品中揮發(fā)性有機(jī)物的檢測方面得到了廣泛應(yīng)用。分子印跡技術(shù)是根據(jù)模板分子與聚合物單體接觸時(shí)會盡可能地同單體形成多重作用點(diǎn)，通過聚合，把這些多重作用點(diǎn)固定或“凍結(jié)”，當(dāng)模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子在空間和結(jié)合位點(diǎn)上相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，這樣的空穴對模板分子具有選擇性。

權(quán)英[8]等以丙烯酰胺的結(jié)構(gòu)類似物丙酰胺為模板分子，采用本體聚合法制備出了對丙烯酰胺具有較好選擇性的印跡聚合物。靜態(tài)吸附平衡實(shí)驗(yàn)和Scatchard分析結(jié)果表明，與非印跡聚合物相比，印跡聚合物對丙烯酰胺具有較強(qiáng)的吸附特性，最大吸附量為4.283 mg/g。JIANG Dong-lei[9]通過在硅膠表面構(gòu)建的丙烯酰胺分子印跡物（MIP）作為填充材料自制SPE柱，進(jìn)行丙烯酰胺樣品前處理。制備的MIP-SPE小柱用于薯?xiàng)l樣品前處理，平均回收率為93.5%，RSD值為2.24%。與C18-SPE柱的特異性吸附比較，其制備的MIP-SPE柱具有極好的選擇性，通過與HPLC的結(jié)合，可用于食品樣品中丙烯酰胺的快速檢測。JI Jian[10]通過表面引發(fā)原子自由基聚合在石墨烯表面構(gòu)建丙烯酰胺分子印跡物，印跡物的吸附能力為123.48 μmol/g，應(yīng)用于薯?xiàng)l樣品前處理，平均回收率為93.7%，RSD值為4.71%。

2 丙烯酰胺檢測方法

由于食品的組成成分復(fù)雜，而且丙烯酰胺的含量很低，國外普遍采用的食品中丙烯酰胺的分析方法主要有氣相色譜法、液相色譜法，特別是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （LC-MS/MS）等檢測方法，準(zhǔn)確性和靈敏性均相應(yīng)提高，是具有潛在發(fā)展前景的檢測方法。

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 （GC-MS）

由于丙烯酰胺的熱不穩(wěn)定性，采用GC進(jìn)行檢測時(shí)，需要對其進(jìn)行化學(xué)衍生，以改善丙烯酰胺的熱不穩(wěn)定性，提高GC檢測方法的靈敏度與專一性。目前，衍生化方法主要為溴化衍生，衍生產(chǎn)物為2，3-二溴丙酰胺或是2-溴丙烯酰胺[11]。

程劼[12]通過氣相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜 （GCMS/MS）結(jié)合兩步衍生法檢測經(jīng)樣品前處理的丙烯酰胺樣品。采集的樣品經(jīng)正己烷萃取，10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，過濾，濾液通過C18 SPE凈化淋洗。凈化后的丙烯酰胺樣品通過KBr，HBr和飽和溴水進(jìn)行初步衍生化，然后滴加硫代硫酸鈉至衍生液褪色，通過乙酸乙酯萃取，過濾。色相色譜條件:TR-5毛細(xì)管氣相色譜柱，柱溫程序:起始溫度70℃，保持1 min，以 15℃/min的速率升溫至 280℃，保持10 min；進(jìn)樣量1 μL。四級桿串聯(lián)質(zhì)譜條件:采用離子反應(yīng)監(jiān)測模式 （SRM），檢測定性離子對m/z 152＞135和 m/z 152 ＞107，定量離子 m/z 152 ＞135，碰撞氣體氬氣能量15 eV。其在3.0～30 ng/g質(zhì)量分?jǐn)?shù)內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，丙烯酰胺的檢出限 （LOD）為1.0 ng/g（S/N=3）。郭志峰[13]建立了一種測定市售鍋巴中的丙烯酰胺含量的方法。該法樣品前處理不必經(jīng)過溴化衍生，樣品脫脂后用水提取丙烯酰胺，提取液過活性炭柱，再用乙酸乙酯將活性炭柱中吸附的丙烯酰胺洗脫，洗脫液濃縮后經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）定量分析，檢測限 （LOD）為 0.06 mg/kg。

2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （LC-MS/MS）

由于GC測定樣品中丙烯酰胺需進(jìn)行溴化衍生，操作繁瑣，對衍生技術(shù)要求較高，難以掌握。采用LC方法不需要衍生，直接對丙烯酰胺進(jìn)行測定，簡化了分析過程，而且測定在常溫下進(jìn)行，克服了熱不穩(wěn)定性[14]。

程江華[15]通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （LC-MS/MS）測定食品樣品中的丙烯酰胺含量，采用的色譜柱為 Atlantis TM C18，質(zhì)譜條件為ESI+模式，毛細(xì)管電壓2.5 kV，丙烯酰胺定性離子（72/55），碰撞能量5 eV。其平均回收率為92.73%，RSD為1.46%，檢測范圍 25～1 600 ng/mL，檢出限（LOD）9.0 ng/mL（S/N=3）。Renzo Bortolomeazzi[16]通過 SPE 柱（填充物:自制C18材料、強(qiáng)陽離子（SCX）和陰離子交換（SAX）吸附劑）對咖啡樣品進(jìn)行前處理，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （LC-MS/MS）測定丙烯酰胺含量。通過氘d3標(biāo)記的丙烯酰胺做內(nèi)標(biāo)，對6種咖啡樣品進(jìn)行測定，其RSD值為5%，最低檢出限 （LOD）為5 μg/kg，定量限 （LOQ） 為 16 μg/kg。

2.3 高效液相色譜 （HPLC-CWO）和氣相色譜（GC-μECD）分析方法

已有報(bào)道利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 （GCMS），和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （LC-MS/MS） 測定食品中的丙烯酰胺，兩種方法對儀器的要求都很高，不適合在普通實(shí)驗(yàn)室中推廣。

張輝珍[17]建立了食品中丙烯酰胺的高效液相色譜 （HPLC-CWO） 和氣相色譜 （GC-μECD） 分析方法。其優(yōu)化了前處理步驟和儀器分析條件，HPLC分析方法采用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液提取，石墨化碳黑固相萃取小柱凈化，甲醇和乙酸銨 體積比5∶3作為流動相測定，其最低檢出限（LOD）為0.01 mg/kg，定量限 （LOQ）為0.05 mg/kg。GC-μECD法則是在強(qiáng)酸體系中，用0.1 mol/L KBrO3和KBr對丙烯酰胺進(jìn)行加成反應(yīng)衍生化，乙酸乙酯提取衍生化產(chǎn)物α，β-二溴丙酰胺，用HP-FFAP毛細(xì)管柱分離，電子捕獲檢測器檢測，最低檢出限（LOD）0.005 mg/kg，定量限（LOQ）為 0.02 mg/kg。

2.4 離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)檢測法

王海波[5]建立了使用離子色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定食品中丙烯酰胺離子的檢測方法。樣品經(jīng)過前處理后，通過離子排斥色譜進(jìn)行分離，質(zhì)譜進(jìn)行定性并進(jìn)行定量計(jì)算。以IonPac AS1分析柱進(jìn)行離子排斥分離。ESI-MS以選擇離子模式對目標(biāo)離子進(jìn)行監(jiān)控，以SIM離子72的峰面積進(jìn)行定量計(jì)算。該方法對丙烯酰胺的檢出限（S/N=3）為 5 μg/L，丙烯酰胺在2～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。程喜明[18]通過使用離子色譜測定油炸食品中丙烯酰胺，樣品前處理方法與FDA提供的方法大致相同。經(jīng)超聲、離心后上清液用離子色譜-紫外檢測器檢測，通過IonPac ICEAS1（4 mm×250 mm） 分離柱，IonPac NG1 （2 mm×250 mm）保護(hù)柱，紫外檢測波長為202 nm。結(jié)果表明其對3種樣品的加標(biāo)回收率在80%以上，RSD＜5%，最低檢出限（LOD）為0.010 mg/kg，相對偏差＜20%。

3 前景展望

不同的前處理技術(shù)有其各自的適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際工作中，應(yīng)根據(jù)待測樣品的種類和基質(zhì)、測定結(jié)果要求和檢測儀器的不同，并結(jié)合實(shí)際條件選用合適的樣品前處理方法。固相微萃取、加速溶劑萃取、基質(zhì)固相分散等新技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用空間。

目前食品中丙烯酰胺的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)尚未建立，各國正廣泛開展食品中丙烯酰胺的研究，嘗試了多種方法測定食品中丙烯酰胺，見諸報(bào)道的有氣相色譜法（GC），液相色譜法（LC），氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （LC-MS/MS）等，但是這些方法在分析時(shí)間、成本及普及性方面各有長短，其最大的問題在于儀器昂貴，樣品前處理方法復(fù)雜繁瑣，成本高，不利于在我國普及。食源性接觸丙烯酰胺對人類健康的影響與分析方法和分析數(shù)據(jù)的可靠性有直接的關(guān)系，食品中痕量丙烯酰胺的檢驗(yàn)重點(diǎn)是做好樣品前處理和檢測方法的選擇。鼓勵(lì)新型的檢測方法，諸如靶細(xì)胞分析定量，DNA損傷測定等生物傳感技術(shù)應(yīng)用于丙烯酰胺的定量和定性分析檢測中。

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