適應(yīng)性進(jìn)化策略強(qiáng)化厭氧產(chǎn)氫菌群的發(fā)酵效能

黃振興 ， 余曉斌 ， 廖家林 ， 阮文權(quán)

（1.江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

厭氧發(fā)酵細(xì)菌由于缺乏完整的電子傳遞體系，代謝過程中底物脫氫產(chǎn)生的電子需要有適當(dāng)?shù)耐緩竭M(jìn)行宣泄，以維持胞內(nèi)的氧化還原平衡，從而保證代謝過程的順利進(jìn)行。通過氫化酶的作用，以鐵氧還蛋白作為電子載體，催化質(zhì)子接受電子產(chǎn)生分子氫，可以作為宣泄電子和維持胞內(nèi)氧化還原平衡的一種調(diào)節(jié)機(jī)制[1]。厭氧混合菌群中同時(shí)存在著產(chǎn)甲烷菌等耗氫微生物，因此目前大多數(shù)研究采用熱處理等方式以殺死混合菌群中的耗氫微生物，同時(shí)保留以芽孢形式存在的梭菌屬產(chǎn)氫發(fā)酵細(xì)菌[2]。梭菌屬產(chǎn)氫發(fā)酵細(xì)菌有著較高的氫氣產(chǎn)率，氫分子形成不僅可以基于丙酮酸脫羧作用 （pyruvateferredoxin oxidoreductase PFOR），而且可以來自于NADH的氧化 （NADH-ferredoxin oxidoreductase，NFOR）[3]。研究表明，在梭菌產(chǎn)氫代謝過程中，氫氣的產(chǎn)率取決于丁酸和乙酸的生成水平，而醇類和乳酸的積累會導(dǎo)致較低的氫產(chǎn)率。然而，丁酸的積累會反饋抑制產(chǎn)氫產(chǎn)酸過程，某些梭菌由于缺乏足夠的耐受能力，就會停止代謝或者轉(zhuǎn)換代謝途徑生成醇類或者乳酸[4]。但是不同梭菌的生理生化行為存在差異，其各自的耐受閾值和響應(yīng)機(jī)制不盡相同[5]。因此厭氧菌群的微生物多樣性和基因型的不確定性會形成其內(nèi)在的異質(zhì)性，在產(chǎn)氫過程中就會形成“短板效應(yīng)”，從而限制了菌群整體的發(fā)酵能力。因此如能消除混合菌群中對丁酸敏感以及富集具有較好丁酸耐受能力的產(chǎn)氫梭菌，消除“短板效應(yīng)”，提高菌群整體水平的丁酸耐受力和持續(xù)生產(chǎn)力，定能強(qiáng)化混合菌群的發(fā)酵制氫能力。

本課題研究中以外源丁酸脅迫結(jié)合競爭性途徑抑制劑作為復(fù)合選擇性壓力，在連續(xù)流中對產(chǎn)氫發(fā)酵菌群進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，在提高菌群整體耐酸水平的同時(shí)，弱化產(chǎn)氫競爭途徑，強(qiáng)化菌群整體水平的產(chǎn)氫能力，并在關(guān)鍵酶學(xué)水平對進(jìn)化機(jī)制進(jìn)行闡釋。

1 材料與方法

1.1 接種物來源及培養(yǎng)基成分

混合菌群取自于蘇州潔凈公司厭氧消化系統(tǒng)中的厭氧污泥。污泥的TS為13.24%，VS為86.46%。將厭氧污泥在100℃下干熱滅菌1 h，這樣可以完全殺死污泥里的產(chǎn)甲烷菌和其它細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞，并能保留芽孢形式的產(chǎn)氫梭菌。經(jīng)過熱處理的厭氧污泥即為本實(shí)驗(yàn)的接種物。培養(yǎng)基中，葡萄糖為唯一碳源，NH4Cl為唯一氮源，添加KH2PO4和 FeCl2·4H2O， 使 m （Glucose）∶m （NH4Cl） ∶m（KH2PO4）∶m（FeCl2·4H2O）=100∶5∶1∶0.3，其它微量營養(yǎng)成分質(zhì)量濃度（mg/L）:MgSO4·7H2O 200；NaCl 20；CaCl2·2H2O 10；L-cysteine 10；Na2MoO4·4H2O 0.5；MnSO4·7H2O 0.5；H3BO30.5；ZnCl20.5；CuCl20.5；CoCl2·2H2O 0.5；Biotin 0.05；Riboflavin 0.05；Nicotinic acid 0.05。

1.2 連續(xù)流中厭氧產(chǎn)氫菌群的適應(yīng)性進(jìn)化

將經(jīng)過熱處理的厭氧污泥接種至含有4 L培養(yǎng)基的厭氧發(fā)酵罐（7 L容量）。通入N25 min后，反應(yīng)器首先在分批模式下啟動，初始接種量和葡萄糖含量分別為4.0 g/L和5.0 g/L。定時(shí)檢測產(chǎn)氫情況，當(dāng)氫氣順利生成后啟動連續(xù)流。反應(yīng)器攪拌速度為150 r/min，溫度控制在35℃。pH采用6 mol/L KOH控制在5.6。水力停留時(shí)間（HRT）最終維持在8 h（Phase I）。在穩(wěn)定運(yùn)行的反應(yīng)器中引入外源丁酸脅迫作為選擇性壓力，并在反應(yīng)器達(dá)到穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)上逐步增加質(zhì)量濃度，最終脅迫質(zhì)量濃度為25 g/L（Phase II）。然后逐步提高進(jìn)水葡萄糖質(zhì)量濃度直到底物除去率低于80%（Phase III）。最后在進(jìn)化體系中引入4-甲基吡唑（醇脫氫酶抑制劑）以及草氨酸鹽（乳酸脫氫酶抑制劑），形成復(fù)合脅迫壓力。

1.3 污泥細(xì)胞提取物、透性化細(xì)胞及總DNA制備

收集60 mL污泥混合液洗滌、離心，然后懸浮于3 mL含有10 mmol/L二硫蘇糖醇 （DTT）的0.1 mol/L Tris/MES（pH 7.2）緩沖液。將污泥懸浮液置Tissuelyzer II破碎儀破細(xì)胞，然后4℃下40 000 g離心30 min以去除細(xì)胞碎片和污泥雜質(zhì)，上清液即為污泥細(xì)胞提取物。污泥透性化細(xì)胞制備按照O’sullivan和Condon提出的方法并做少許修改[6]。污泥懸浮液加入體積分?jǐn)?shù)10%甲苯，并在液氮中凍融兩次。污泥總DNA的提取采用Mobio公司的PowerSoil DNA isolation kit試劑盒，并按照說明書操作。

1.4 氫化 酶 （hydrogenase）、NFOR、 膜 ATPase（membrane ATPase）活性測定

Membrane ATPase活性測定反應(yīng)體系 （1 mL）:50 mmol/L Tris-maleate，10 mmol/L MgSO4，0.2 mol/L ATP，100 μL透性細(xì)胞懸浮液。酶活定義為每分鐘釋放1 μmol磷酸根離子所需要的酶量。

NADH-ferredoxin oxidoreductase（NFOR）活性測定反應(yīng)體系（1 mL）:50 mmol/L Tris-MES；2 mmol/L DTT；7 mmol/LMNADH；4 mmol/L acetyl-CoA； 2 mmol/L 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）；101 325 Pa CO； 10 μmol/L FAD； 200 μL 細(xì)胞提取物。酶活定義為每分鐘生成1 μmol TF所需要的酶量。

Ferredoxin-NAD+oxidoreductase（FNOR）活性測定反應(yīng)體系（1 mL）:50 mmol/L Tris-MES， 2 mmol/L甲基紫晶，60 mmol/L亞硫酸鈉，5 mmol/L NAD+，101 325 Pa CO， 10 mmol/L DTT， 200 μL cell extract。酶活定義為每分鐘釋放1 μmol NADH所需要的酶量。

Hydrogenase活性測定反應(yīng)體系 （1 mL）:50 mmol/L Tris-MES，2 mmol/L甲基紫精，60 mmol/L亞硫酸氫鈉，100 μL細(xì)胞提取物。酶活定義為每分鐘釋放1 μmol氫氣所需要的酶量。

1.5 PCR-DGGE表征進(jìn)化過程中微生物群落的動態(tài)變化

采用細(xì)菌通用引物F341與R534對污泥總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物F341的5’端帶有GC夾[7]；PCR反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性 4 min，94℃變性 1 min，65℃退火 1 min，之后每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，72℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)，然后再以94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸6 min。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。采用突變凝膠電泳（DGGE）對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，用SYBR Green I染色后拍照觀察。將DGGE指紋圖譜與發(fā)酵參數(shù)結(jié)合分析群落進(jìn)化過程。

1.6 分析方法

污泥生物量以揮發(fā)性懸浮物（VSS）計(jì)，按照國標(biāo)法測定；葡萄糖含量利用生物傳感器測定；氣相產(chǎn)物采用氣相色譜儀測定；液相產(chǎn)物采用液相色譜儀測定；TF采用分光光度計(jì)測定；NADH含量采用酶法進(jìn)行測定[8]；磷酸根離子含量采用多參數(shù)水質(zhì)分析儀測定，發(fā)酵液總碳含量用TOC測定儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 在連續(xù)流中，以丁酸作為選擇性壓力對厭氧污泥進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化

如圖1所示，和已有研究結(jié)果一致，厭氧菌群在低負(fù)荷（Phase I）運(yùn)行條件下，液相產(chǎn)物主要為丁酸和乙酸，兩者碳含量占液相產(chǎn)物總碳的90%以上。DGGE圖譜分析表明，此時(shí)的微生物多樣性顯著。在此基礎(chǔ)上逐漸引入外源丁酸脅迫，脅迫終質(zhì)量濃度為25 g/L（Phase II）。在此穩(wěn)態(tài)基礎(chǔ)上的DGGE分析表明微生物多樣性顯著降低，說明一些酸敏感微生物由于缺乏足夠的酸耐受能力，其生長受到抑制，在連續(xù)流中被淘汰出反應(yīng)器或者喪失了其生長優(yōu)勢。但是代謝產(chǎn)物分析表明，丁酸脅迫在低負(fù)荷下并沒有誘導(dǎo)醇類等競爭性產(chǎn)物生成，反應(yīng)器中的代謝產(chǎn)物主要還是丁酸和乙酸。這可能是因?yàn)樗缶a(chǎn)醇或者產(chǎn)乳酸途徑的引發(fā)需要足夠ATP庫或者較高的底物濃度[4]。因此，在外源丁酸脅迫的基礎(chǔ)上，逐漸提高培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度，直到底物降解率下降到80%以下，其目的在于充分激發(fā)某些梭菌以產(chǎn)醇途徑的轉(zhuǎn)化來應(yīng)對丁酸脅迫的可能性（Phase III）。在此條件下反應(yīng)器達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，發(fā)現(xiàn)有大量的丁醇、乙醇和乳酸生成，這說明某些梭菌在低負(fù)荷下可以依賴自身一定的耐酸機(jī)制來抵御酸脅迫，但是高負(fù)荷下其又通過產(chǎn)醇和產(chǎn)乳酸途徑的轉(zhuǎn)換來響應(yīng)。這種現(xiàn)象會造成高負(fù)荷下產(chǎn)氫過程的短板效應(yīng)，從而限制了厭氧菌群的產(chǎn)氫能力。同時(shí)DGGE結(jié)果表明，當(dāng)有機(jī)負(fù)荷提高以后，微生物的多樣性有所增加。這可能是由于在丁酸脅迫壓力和低負(fù)荷條件下，某些梭菌由于缺乏足夠的耐酸能力，其生長能力在厭氧菌群中處于劣勢但是并沒有完全淘汰出反應(yīng)器，當(dāng)有機(jī)負(fù)荷提高后，其又可通過產(chǎn)醇或者產(chǎn)乳酸來抵御丁酸脅迫并恢復(fù)其生長優(yōu)勢，從而展現(xiàn)在DGGE圖譜中。為了消除以上存在的不利現(xiàn)象，在進(jìn)化過程中繼續(xù)引入（醇脫氫酶抑制劑）以及草氨酸鹽（乳酸脫氫酶抑制劑）來抑制產(chǎn)醇和產(chǎn)乳酸途徑，兩種抑制劑的最終濃度為12 mmol/L和20 mmol/L。當(dāng)反應(yīng)器達(dá)到穩(wěn)態(tài)后（Phase IV），分析發(fā)現(xiàn)，乙醇、丁醇以及乳酸生成受到明顯抑制，乙酸和丁酸再次成為主要的代謝產(chǎn)物。此階段的DGGE指紋分析表明，微生物的多樣性大幅降低，只存在3種較為明顯的條帶。這是因?yàn)樵诟哓?fù)荷下那些依賴代謝途徑轉(zhuǎn)化來抵御丁酸脅迫的梭菌，由于其響應(yīng)策略受到化學(xué)抑制劑的阻礙而無法進(jìn)行，這時(shí)其胞內(nèi)的pH動態(tài)平衡或者氧化還原平衡將被打破，其生長能力受到嚴(yán)重抑制，從而在連續(xù)流中被淘汰出反應(yīng)器。通過以上的適應(yīng)性進(jìn)化過程，具有較強(qiáng)丁酸脅迫耐受力，且是不依賴于代謝途徑轉(zhuǎn)換的產(chǎn)氫菌可以在反應(yīng)器中得到富集。

圖1 適應(yīng)性進(jìn)化過程中代謝產(chǎn)物的碳分布以及微生物群落的演替Fig.1 Carbon distribution and bacterial community succession during the adaptive evolution

2.2 適應(yīng)性進(jìn)化策略對厭氧產(chǎn)氫的強(qiáng)化作用

為了驗(yàn)證適應(yīng)性進(jìn)化策略對產(chǎn)氫發(fā)酵的作用，本課題研究中分別對原污泥和進(jìn)化污泥在高濃度有機(jī)物條件下的產(chǎn)氫潛力進(jìn)行研究。兩種污泥的發(fā)酵產(chǎn)物含量變化如圖2所示。隨著時(shí)間變化，產(chǎn)物含量越來越高，32 h之后葡萄糖含量都在200 mg/L以下，降解率都接近于100%。碳平衡都達(dá)到98%以上，說明沒有重要的產(chǎn)物測定遺漏。由圖2（b）可見，在原污泥的發(fā)酵過程中，4 h的時(shí)候開始出現(xiàn)醇類產(chǎn)物，此時(shí)有機(jī)酸含量為0.88 g/L（12.6 mmol/L）。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，總的醇類產(chǎn)量為6.49 g/L，主要包括乙醇（3.05 g/L），丁醇（2.48 g/L）和丙酮（0.96 g/L），沒有乳酸的生成；同時(shí)總酸的產(chǎn)量為7.07 g/L，包括丁酸（50.0 mmol/L）和乙酸（44.5 mmol/L）。 由于醇類積累，氫氣產(chǎn)率和產(chǎn)生速率分別僅1.43 mol-H2/mol-Glucose 和 0.168 L/（L·h）。 相比較的是在進(jìn)化污泥的發(fā)酵過程（圖2（a））中，氫氣產(chǎn)率和生成速率增加了56.5%，分別達(dá)到了2.25 mol-H2/mol-Glucose和0.263 L/（L·h），乙酸/丁酸增加到了 1.33，丁酸和乙酸產(chǎn)量分別達(dá)83.3 mmol/L和111.2 mmol/L。此外，進(jìn)化污泥的發(fā)酵過程中出現(xiàn)了少量琥珀酸，意味著在厭氧菌群的進(jìn)化過程中可能有新的代謝途徑得到了誘導(dǎo)。最近研究表明，一些厭氧菌特別是一些梭菌屬的微生物具有分支的TCA循環(huán)。這樣的TCA循環(huán)一方面可以提供谷氨酸等氨基酸合成的前體物質(zhì)，充足的氨基酸庫有助于一些氨基酸依賴型耐酸系統(tǒng)的運(yùn)行[9]；另一方面依賴分支TCA循環(huán)，琥珀酸可以在一些脅迫環(huán)境下正向或者反向合成，這對細(xì)胞保持NAD+/NADH平衡起到一定的作用[10]。因此在進(jìn)化污泥的發(fā)酵過程中琥珀酸的形成，一方面可能是因?yàn)檫M(jìn)化污泥中氨基酸依賴型耐酸系統(tǒng)的誘導(dǎo)而形成，另一方面也可能是由于耐丁酸微生物為了保持自身的NAD+/NADH平衡而形成的一種輔助調(diào)節(jié)機(jī)制。

圖2 進(jìn)化污泥和原污泥的發(fā)酵性能比較Fig.2 Comparison of fermentation performances between evolved cultures and original cultures at a high initial glucose concentration of 30 g/L

2.3 進(jìn)化機(jī)制在酶學(xué)水平的解析

以上結(jié)果表明，進(jìn)化污泥和原污泥在高有機(jī)負(fù)荷下的代謝表現(xiàn)存在明顯差異。為了闡釋其內(nèi)在差異，作者對產(chǎn)氫和耐酸性相關(guān)酶學(xué)水平的表現(xiàn)進(jìn)行了研究，以解析其進(jìn)化機(jī)制。將原污泥與進(jìn)化污泥分別接種至發(fā)酵罐中，反應(yīng)條件參照2.2節(jié)。在發(fā)酵產(chǎn)氫過程的指數(shù)期取樣測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種產(chǎn)氫菌群在酶學(xué)水平上存在著顯著差異。如圖3所示，在進(jìn)化污泥中，氫化酶、Membrane ATPase以及NFOR的比酶活分別為260 U/g，200 U/g及36 U/g，而原始污泥中其比酶活僅分別為128 U/g，126 U/g以及29 U/g。Membrane ATPase是微生物主要的耐酸機(jī)制之一，其高活性說明進(jìn)化污泥有著較好的耐酸潛力以保證其在高負(fù)荷下丁酸和乙酸的持續(xù)生成。此外，丁酸和乙酸的生成過程中，其產(chǎn)生的電子需要及時(shí)得到宣泄，而進(jìn)化污泥產(chǎn)醇和產(chǎn)乳酸途徑的削弱，電子則主要依賴釋氫作用宣泄，因此氫化酶和NFOR的高活性可以保證負(fù)荷提升之后的高產(chǎn)氫效率。原污泥中的某些梭菌由于相對低的耐酸能力和釋氫活性，其不僅造成了菌群整體水平的活性降低，而且當(dāng)負(fù)荷提高之后，耐受機(jī)制無法應(yīng)對發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸脅迫，就會通過代謝途徑轉(zhuǎn)化來維持代謝活性，從而在產(chǎn)氫過程中導(dǎo)致短板效應(yīng)，氫氣產(chǎn)率大大降低。但是在進(jìn)化污泥和原始污泥中都存在著相當(dāng)?shù)腇NOR活性。

圖3 產(chǎn)氫和耐酸性相關(guān)酶活水平的比較Fig.3 Comparison of enzymatic activity involved in H2 and acid tolerance

FNOR是產(chǎn)醇途徑中代表性的一種酶，其與NFOR分別催化電子在鐵氧還蛋白和NAD+之間的相互傳遞，如公式 （1）所示。但是基于NFOR的NADH氧化產(chǎn)氫熱力學(xué)上是不可行的，其已被證實(shí)可以被丁酸合成途徑中巴豆酰輔酶A的還原放能反應(yīng)所驅(qū)動，在梭菌中此耦合反應(yīng)由丁酰輔酶A脫氫酶復(fù)合物（ETF/BCD）所介導(dǎo)，如公式（2）所示[11-12]。因此NFOR與FNOR很有可能是一種鐵氧還蛋白氧化還原酶催化的正逆反應(yīng)，只是其反應(yīng)過程并不一致。NFOR需要ETF/BCD介導(dǎo)的放能反應(yīng)驅(qū)動，其測定過程必須要加入乙酰輔酶A或者巴豆酰輔酶A，所以此方向的活性很大程度上取決于丁酸合成途徑的活性。而在FNOR反應(yīng)方向下不需要任何其它反應(yīng)參與，所以比酶活取決于細(xì)胞提取物中酶本身的含量和催化活性。以上分析說明，此酶的反應(yīng)方向或活性取決于丁酸合成活性，反過來說丁酸積累不僅會導(dǎo)致酸脅迫效應(yīng)，而且會反饋抑制基于NFOR的NADH氧化，從而造成NAD+再生壓力。這也很好地解釋了為什么是丁酸而不是乙酸、乳酸等其它有機(jī)酸能夠激活產(chǎn)醇等競爭性途徑。

3 結(jié)語

1）在連續(xù)流中，通過適應(yīng)性進(jìn)化手段，消除了厭氧菌群中對丁酸敏感以及依賴代謝途徑轉(zhuǎn)換來抵御丁酸脅迫的產(chǎn)氫梭菌，有效抑制了產(chǎn)氫菌群整體水平上的代謝異質(zhì)性，從而顯著弱化了產(chǎn)氫菌群在發(fā)酵過程中的短板效應(yīng)。

2）相較于原始污泥，進(jìn)化污泥在利用高濃度底物產(chǎn)氫過程中競爭性途徑活性大大減弱，而丁酸和乙酸的持續(xù)生成力更強(qiáng)，從而獲得了較高的氫氣產(chǎn)率。

3）耐酸機(jī)制和產(chǎn)氫作用相關(guān)酶活分析表明，較于原始污泥，進(jìn)化污泥的Membrane ATPase、氫化酶以及NFOR活性更強(qiáng)，其保證了在高負(fù)荷下厭氧菌群氫氣、乙酸以及丁酸的持續(xù)生產(chǎn)力。

[1]Valdez-Vazquez I，Poggi-Varaldo H M.Hydrogen production by fermentative consortia[J].Renew Sust Energ Rev，2009，13:1000-1013.

[2]Das D.Advances in biohydrogen production processes:an approach towards commercialization[J].Int J Hydrogen Energy，2009，34:7349-7357.

[3]Sinha P，Pandey A.An evaluative report and challenges for fermentative biohydrogen production[J].Int J Hydrogen Energy，2011，36:7460-7478.

[4]Van Ginkel S，Logan B E.Inhibition of biohydrogen production by undissociated acetic and butyric acids[J].Environ Sci Technol，2005，39:9351-9356.

[5]Lidstrom M E，Konopka M C.The role of physiological heterogeneity in microbial population behavior[J].Nat Chem Biol，2010（6）:705-712.

[6]O’sullivan E，Condon S.Relationship between acid tolerance，cytoplasmic pH，and ATP and Ht-ATPase levels in chemostat cultures of Lactococcus lactis[J].Appl Environ Microb，1999，65（6）:2287-2293.

[7]Huang Y，Zong W M，Yan X，et al.Succession of the bacterial community and dynamics of hydrogen producers in a hydrogenproducing bioreactor[J].Applied and Environmental Microbiology，2010，76（10）:3387-3390.

[8]李駱冰，王永紅，莊英萍，等.乙醇發(fā)酵中釀酒酵母輔酶NAD+及NADH測定方法[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（2）:287-293.LI Luo-bing，WANG Yong-hong，ZHUANG Ying-ping，et al.Determination of coenzyme NAD+and NADH of Saccharomyces cerevisiae cells in ethanol production[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（2）:287-293.（in Chinese）

[9]孟影，張光生，王愛杰，等.生物產(chǎn)氫過程中厭氧污泥耐酸響應(yīng)的生物化學(xué)機(jī)制[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31（3）:301-311.MENT Ying，ZHANG Guang-sheng，WANG Ai-jie，et al.Acid tolerance response of anaerobic sludge with butyrie acid stress during the enhanced biohydrogen process[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（3）:301-311.（in Chinese）

[10]Crown S B，Indurthi D C，Ahn W S，et al.Resolving the TCA cycle and pentose-phosphate pathway of Clostridium acetobutylicum ATCC 824:Isotopomer analysis，in vitro activities and expression analysis[J].Biotechnol J，2011（6）:300-305.

[11]Li F L，Hinderberger J L，Seedorf H N，et al.Coupled ferredoxin and crotonyl coenzyme A（CoA） reduction with NADH catalyzed by the Butyryl-CoA Dehydrogenase/Etf complex from Clostridium kluyveri[J].Journal of Bacteriology，2008，190（3）:843-850.

[12]Seedorf H N，Ricke W F，Veith B，et al.The genome of Clostridium kluyveri，a strict anaerobe with unique metabolic features[J].Proc Natl Acad Sci，2008，105（6）:2128-2133.