氧糖剝奪對(duì)體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Cdh1蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制＊

邱 瑾， 姚文龍， 張 玥， 鄒姮婧， 燕 琳， 張傳漢

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，武漢 430030

Cdh1 是細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物（anaphase promoting complex，APC）的調(diào)節(jié)亞基，在調(diào)控細(xì)胞增殖、糖代謝、膠質(zhì)細(xì)胞遷移、軸突生長(zhǎng)等多種細(xì)胞功能中都發(fā)揮著重要作用［1］。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)，Cdh1蛋白在大鼠全腦缺血模型海馬組織中表達(dá)下降，可能參與了腦缺血的發(fā)病機(jī)制［2］，但引起Cdh1蛋白表達(dá)下降的原因目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察體外純化培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪（oxygen－glucose deprivation，OGD）后Cdh1蛋白的表達(dá)變化，及其是否與細(xì)胞外液葡萄糖含量有關(guān)，為進(jìn)一步明確缺血缺氧性腦損傷的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外純化培養(yǎng)

根據(jù)McCarthy 等［3］報(bào)道的方法，取新生1～2 d SD 大鼠，75%乙醇消毒，無(wú)菌操作下取出全腦浸于4℃預(yù)冷D－h(huán)anks液中，用眼科鑷快速剝除腦膜及小腦，夾取皮層置于另一玻璃皿中。仔細(xì)剪碎皮層組織后，離心棄上清，加入0.25%胰酶，吹打懸浮細(xì)胞團(tuán)后，37℃消化15 min，中間間隔振蕩離心管壁，促進(jìn)細(xì)胞懸浮。終止消化后，離心棄上清，加入含10%胎牛血清（Gibco公司），青霉素100U／mL，鏈霉素100mg／mL的DMEM／F12（Gibco公司）培養(yǎng)液中，輕柔吹打制備單細(xì)胞懸液，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，差速培養(yǎng)0.5h 后，取懸液種于新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃溫箱培養(yǎng)，平均3～4d換液。細(xì)胞培養(yǎng)7～10d后，于37℃恒溫?fù)u床250r／min 過(guò)夜，以去除小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。0.25%胰酶消化后，接種于新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)7～10d后，重復(fù)純化傳代，得到成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型處理

①以1.5×105／cm2的密度接種星形膠質(zhì)細(xì)胞于3.5cm 培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)培養(yǎng)皿，分別為對(duì)照組、氧糖剝奪1h復(fù)氧組、氧糖剝奪6 h復(fù)氧組。細(xì)胞接種3d后，參考Lee等［4］的方法，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)分組情況，以含糖或不含糖Earle’s平衡液（NaCl 117mmol／L，KCl 5.4mmol／L，CaCl21.8 mmol／L，NaHCO326 mmol／L，MgSO40.8 mmol／L，NaH2PO41.0 mmol／L，Glucose 5.6mmol／L）沖洗細(xì)胞2 遍以去除血清的影響，對(duì)照組加入2mL 含糖Earle’s平衡液，繼續(xù)常氧培養(yǎng)，氧糖剝奪1h復(fù)氧組及氧糖剝奪6h復(fù)氧組每培養(yǎng)皿加入2mL不含糖Earle’s平衡液，放入密閉小室內(nèi)，通入混合氣體（5%CO2，95%N2）進(jìn)行1h或6h的缺氧處理，隨后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)48h后棄液，預(yù)冷PBS沖洗2遍，提取細(xì)胞總蛋白。

②同樣以1.5×105／cm2的密度接種純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞于3.5cm 培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為對(duì)照組、氧糖剝奪6h組、單純?nèi)毖?h組，于接種細(xì)胞3d后，棄培養(yǎng)液并沖洗細(xì)胞后，對(duì)照組及單純?nèi)毖?h組每培養(yǎng)皿加入2mL含糖Earle’s平衡液，氧糖剝奪6h組每培養(yǎng)皿加入2mL 不含糖Earle’s平衡液，對(duì)照組常氧培養(yǎng)，氧糖剝奪6h組及單純?nèi)毖?h組進(jìn)行缺氧處理，6h 后收集培養(yǎng)液上清，血糖儀（Roche公司）檢測(cè)葡萄糖含量，同時(shí)將培養(yǎng)皿中細(xì)胞用預(yù)冷PBS沖洗2遍，提取總蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Western blot檢測(cè)

以含PMSF（1μmol／L）的RIPA 裂解液冰上充分裂解細(xì)胞，收集裂解液于4℃離心收集上清，加入上樣緩沖液，100℃蛋白變性10min。以β－actin為內(nèi)參，取等量的蛋白質(zhì)經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫慢搖封閉1h，以兔抗Cdh1多克隆抗體（北京奧維亞，1∶400），或兔抗Skp2 多克隆抗體（武漢博士德，1∶400）或小鼠抗β－actin單克隆抗體（武漢博士德，1∶400）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 漂洗3遍后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（武漢博士德，1∶3 000），室溫慢搖孵育1h，TBST 漂洗3遍后進(jìn)行ECL 顯色（Pierce 公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO－RAD公司）進(jìn)行掃描照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，3組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同程度氧糖剝奪／復(fù)氧對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞Cdh1及Skp2蛋白表達(dá)的影響

如圖1所示，體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，氧糖剝奪1h或6h并復(fù)氧48h后，Cdh1蛋白表達(dá)均下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；氧糖剝奪1h或6h并復(fù)氧48h后，與對(duì)照組相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞中Skp2蛋白表達(dá)均增加（P＜0.05）；氧糖剝奪1h及6h復(fù)氧兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞不同程度氧糖剝奪／復(fù)氧后Cdh1及Skp2蛋白的表達(dá)變化Fig.1 The change in the expression of Cdh1and Skp2in astrocytes after OGD／recovery

2.2 單純?nèi)毖跫把跆莿儕Z對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞Cdh1蛋白表達(dá)影響的比較

單純?nèi)毖?h后，體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cdh1蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著變化；氧糖剝奪6h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Cdh1蛋白表達(dá)明顯下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；氧糖剝奪6h與單純?nèi)毖?h引起的Cdh1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 葡萄糖對(duì)缺氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Cdh1蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of glucose on the expression of Cdh1in astrocytes after hypoxia

2.3 細(xì)胞外液葡萄糖6h攝取率的檢測(cè)

含糖的Earle’s平衡液中葡萄糖初始含量為5.6mmol／L。常氧條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞在含糖的Earle’s平衡液中培養(yǎng)6h后，培養(yǎng)液中葡萄糖含量為（4.09±0.52）mmol／L；缺氧條件下，用含糖的Earle’s平衡液培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞6h后，培養(yǎng)液中葡萄糖含量為（4.40±0.38）mmol／L。兩組培養(yǎng)液中葡萄糖含量均下降。計(jì)算細(xì)胞外液葡萄糖攝取率，缺氧組葡萄糖攝取率（21.43±6.74）%低于常氧組（26.98±9.21）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

3 討論

Cdh1作為APC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)亞基，主要通過(guò)D－box、KEN box以及A－Box等特殊的結(jié)構(gòu)域識(shí)別底物，形成APC－Cdh1－底物復(fù)合物，從而啟動(dòng)底物蛋白的泛素化降解［5－6］。探討引起Cdh1在星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪后表達(dá)變化的因素，對(duì)治療缺血性腦損傷具有重要意義。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞能耐受一定程度的缺氧，而神經(jīng)元缺氧后極易損傷，可能與二者細(xì)胞內(nèi)不同的Cdh1活性有關(guān)［7－8］。生理狀態(tài)下，神經(jīng)元細(xì)胞中Cdh1活性高于星形膠質(zhì)細(xì)胞，Cdh1通過(guò)泛素化降解Pfkfb3，使神經(jīng)元細(xì)胞中僅在mRNA水平能檢測(cè)到Pfkfb3 表達(dá)，而在蛋白水平Pfkfb3完全消失。Pfkfb3可以產(chǎn)生果糖－2，6－二磷酸，是糖酵解限速酶磷酸果糖激酶－1（Phosphofructokinase－1，PKF－1）最有效的激活劑［9］。因此神經(jīng)元在缺氧后難以通過(guò)糖酵解提供能量。相反，星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺氧后能夠有效啟動(dòng)糖酵解，具有一定的缺氧耐受性，與細(xì)胞內(nèi)Pfkfb3未被Cdh1完全降解有關(guān)，較低的Cdh1活性是在缺氧條件下能否啟動(dòng)糖酵解，繼續(xù)提供能量的關(guān)鍵［7，10］。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的葡萄糖主要儲(chǔ)存于星形膠質(zhì)細(xì)胞中。當(dāng)體外純化培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，因缺少神經(jīng)元缺氧損傷的信號(hào)刺激，能量供應(yīng)負(fù)荷也同時(shí)下降，星形膠質(zhì)細(xì)胞的缺氧耐受時(shí)間與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有所不同。體外實(shí)驗(yàn)已有報(bào)道，完全氧糖剝奪1h復(fù)氧48～72h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)性增殖，活細(xì)胞數(shù)量上升，而在氧糖剝奪4h復(fù)氧48h后，檢測(cè)到星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死，活細(xì)胞數(shù)量下降［11］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)比觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞體外氧糖剝奪1h及6h，復(fù)氧48h后細(xì)胞內(nèi)Cdh1蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，兩組Cdh1 蛋白表達(dá)均下降，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們推測(cè)，氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cdh1活性的進(jìn)一步下調(diào)與大量激活的糖酵解有關(guān)，而這一變化不受缺氧時(shí)間長(zhǎng)短的影響。

Skp2作為SCF復(fù)合物泛素化降解細(xì)胞周期相關(guān)蛋白途徑的關(guān)鍵點(diǎn)，與細(xì)胞增殖與凋亡都有一定的關(guān)聯(lián)［12］。同時(shí)，Skp2也是Cdh1泛素化降解的下游底物之一［13］。我們前期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，大鼠全腦缺血模型海馬組織中Cdh1 蛋白表達(dá)下降，而Skp2蛋白表達(dá)上升，提示Skp2參與了缺血性腦損傷發(fā)生機(jī)制，其表達(dá)增加可能與Cdh1活性下降有關(guān)［2，14］。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，與氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Cdh1蛋白表達(dá)下降相對(duì)應(yīng)的，Skp2蛋白表達(dá)明顯增加，再次證實(shí)了前述推測(cè)。

體外氧糖剝奪／復(fù)氧模型中，涉及了氧糖剝奪、復(fù)氧兩個(gè)階段，為進(jìn)一步明確引起Cdh1蛋白變化的具體機(jī)制，我們?cè)谛切文z質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪6h后，立即檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cdh1 蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Cdh1 蛋白表達(dá)明顯下降，說(shuō)明Cdh1蛋白的表達(dá)變化參與的是氧糖剝奪的損傷機(jī)制。而在單純?nèi)毖?h組，細(xì)胞外液持續(xù)供應(yīng)葡萄糖的情況下，Cdh1蛋白表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生顯著變化，與氧糖剝奪6h引起的Cdh1蛋白表達(dá)下降相比，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此我們推測(cè)，細(xì)胞外液中是否存在持續(xù)供應(yīng)的葡萄糖，與缺氧后Cdh1蛋白表達(dá)下降有著密切聯(lián)系。為驗(yàn)證細(xì)胞外液中的葡萄糖在缺氧后繼續(xù)參與了細(xì)胞代謝，我們對(duì)比了常氧培養(yǎng)6h及缺氧培養(yǎng)6h細(xì)胞外液中葡萄糖含量的變化。結(jié)果顯示，即使在缺氧環(huán)境中，細(xì)胞外液中的葡萄糖依舊被攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但其攝取率低于常氧情況下。

綜上可知，氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Cdh1蛋白表達(dá)下降，Skp2蛋白表達(dá)增加，與體內(nèi)模型中結(jié)果一致，其變化不受氧糖剝奪程度的影響而改變；氧糖剝奪引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Cdh1蛋白表達(dá)下降可能與細(xì)胞外液中缺少葡萄糖有關(guān)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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