反義寡核苷酸對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響＊

雷水生， 鄧 鎮(zhèn)， 朱曉琴， 朱 璐， 張遠(yuǎn)紅， 唐曉丹， 孫 丹， 劉光敏

廣州醫(yī)學(xué)院 1 第五附屬醫(yī)院皮膚科，2 生理學(xué)教研室，廣州 510700

血管瘤以內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增生和高表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）為特征，VEGF 是目前已知的20多種血管生長(zhǎng)因子中重要的促血管生成因子，也是治療腫瘤的理想靶點(diǎn)之一［1－2］。反義寡核苷酸（AS－ODN）藥物是一類(lèi)作為腫瘤基因治療的較有前途的新型藥物［3－4］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用VEGF AS－ODN能顯著抑制皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖［5］。為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，本研究將采用RT－PCR 法和ELISA 法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子反義寡核苷酸（VEGF AS－ODN）作用后皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA 的表達(dá)及培養(yǎng)上清液中VEGF 蛋白分泌的改變，以期為皮膚血管瘤的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

血管瘤組織標(biāo)本來(lái)源于廣州市第八人民醫(yī)院皮膚科，要求患者年齡在6 個(gè)月以內(nèi)，腫瘤處在增生期，術(shù)前未進(jìn)行任何治療。細(xì)胞培養(yǎng)用M199 和RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司。陽(yáng)離子脂質(zhì)體、寡核苷酸、Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等試劑購(gòu)于上海生工生物工程公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

無(wú)菌條件下將分離的皮膚血管瘤組織剪碎成1 mm×1mm×1mm 大小，接種于含M199的培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。48h后更換RPMI 1640培養(yǎng)液，以后每隔3～4d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合成片鋪滿瓶底即可傳代。

血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定：制成細(xì)胞爬片后采用血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物vWF（von Will brand factor）按SP 法進(jìn)行染色，方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.4%錐蟲(chóng)藍(lán)拒染法檢測(cè)活細(xì)胞率＞95%。

1.3 寡核苷酸的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)計(jì)算機(jī)程序模擬設(shè)計(jì)出互補(bǔ)于VEGF mRNA 的反義片段，用391A DNA 合成儀合成，PAGE電泳純化，作用于VEGF 第3外顯子（E3），并同時(shí)針對(duì)反義的片段分別合成正義和錯(cuò)義寡核苷酸片段。所有寡核苷酸鏈全硫代磷酸化修飾，由上海生工生物工程有限公司合成，凍干粉保存?zhèn)溆?。AS－ODN 序列為：5′－GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC－3′；S－ODN 序列為：5′－CTATCAGCGCAGCTACTGC－3′；M－ODN 序列為：5′－CCTCGTCATGAGACACGTC－3′；M－ODN 經(jīng)基因庫(kù)檢索與任何已知的人類(lèi)基因無(wú)同源性。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與寡核苷酸導(dǎo)入

1.4.1 溶液配制 無(wú)菌條件下配置A 液、B液和C液。A 液：無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)液適量溶解ASODN、S－ODN、M－ODN，室溫下靜置30 min；B 液：脂質(zhì)體加入適量無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)液中，放置5～10min；C液：將A 液與B 液輕輕混合，室溫孵育15～20min。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為4組：AS－ODN 組、SODN 組、M－ODN 組、空白對(duì)照組。各個(gè)處理組設(shè)0、2.5、5.0、10.0、15.0μmol／L 5 個(gè)濃度。對(duì)照組和處理組各個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)6h細(xì)胞貼壁后行3條寡核苷酸鏈脂質(zhì)體攜帶轉(zhuǎn)運(yùn)，無(wú)血清阻斷4h后，恢復(fù)10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清培養(yǎng)條件。轉(zhuǎn)染后48h［5］收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 轉(zhuǎn)染后RT－PCR進(jìn)行皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA的定量分析

離心收集各組細(xì)胞沉淀，用PBS 洗滌細(xì)胞3次，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的純度及濃度。取5μL RNA 用于逆轉(zhuǎn)錄，方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)方法參照文獻(xiàn)［6－7］。所有引物由上海生工合成、純化。設(shè)計(jì)的VEGF 引物可以檢測(cè)到VEGF 的2 種分泌型異構(gòu)體：VEGF121 （NM 003376）和 VEGF165 （NM 003376）。經(jīng)過(guò)RT－PCR 擴(kuò)增后VEGF121 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為516bp，VEGF165長(zhǎng)度為648bp。GAPDH（NM 017008）長(zhǎng)度為208bp。分別取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μL 用于PCR，25μL 體系包括10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol／L dNTP mix 1μL，上下游引物各1μL，Taq DNA polymerase 0.5μL，模板cDNA 2.5μL，高壓滅菌蒸餾水16.5μL。VEGF PCR 條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1 min，30 次循環(huán)后72℃延伸10min。取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶（EB）染色后對(duì)電泳條帶進(jìn)行掃描分析，計(jì)算VEGF與GAPDH 的比值作為VEGF 表達(dá)水平參數(shù)，對(duì)VEGF PCR 產(chǎn)物進(jìn)行相對(duì)定量。

1.6 ELISA法檢測(cè)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白分泌的改變

分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞，將所收細(xì)胞懸浮于PBS，并超聲裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液于4℃，800r／min離心10min 后取上清檢測(cè)，0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，－20℃凍存；設(shè)計(jì)酶標(biāo)板布局，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；嚴(yán)格按照VEGF ELISA 試劑盒操作要求依次加樣、孵育、洗板、加酶標(biāo)抗體、孵育、洗板、加底物、孵育、終止反應(yīng)、酶標(biāo)儀比色等過(guò)程。檢測(cè)皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF 蛋白分泌水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AS－ODN 作用于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后VEGF mRNA 表達(dá)的改變

RT－PCR 結(jié)果（圖1）顯示，皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)516bp（VEGF121）和648bp（VEGF165）2個(gè)片段，主要以VEGF121 表達(dá)為主。電泳圖像顯示5.0μmol／L的AS－ODN 作用48h后，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF 516bp條帶豐度較空白組減弱，648 bp條帶消失，而S－ODN 組、M－ODN 處理組VEGF條帶未見(jiàn)明顯改變。

定量分析 VEGF 121 電泳圖像（AVEGF／AGAPDH），AS－ODN 組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF121 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）。而S－ODN 組、M－ODN 處理組與空白對(duì)照組比較，其VEGF121 mRNA 表達(dá)未見(jiàn)明顯改變（均P＞0.05）。由于本身弱表達(dá)的VEGF165經(jīng)低濃度AS－ODN（5.0μmol／L）作用后648bp 條帶消失，故未對(duì)VEGF165 圖像掃描吸光度值進(jìn)行分析（表1）。

在相同的作用時(shí)間（48h）下，經(jīng)不同濃度ASODN（2.5～15.0μmol／L）作用后，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF121mRNA 表達(dá)量（A 值）呈劑量依賴性減少（表2）。

圖1 5.0μmol／L各組寡核苷酸（SP－ODN）作用48h 后內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA 的表達(dá)Fig.1 The expression level of VEGF mRNA in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with 5.0μmol／L SP－ODN for 48h

2.2 AS－ODN 作用后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白分泌的改變

ELISA 法檢測(cè)結(jié)果顯示，皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞分別經(jīng)5.0μmol／L 寡核苷酸作用48h 后，其中AS－ODN 處理組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF濃度均較S－ODN 組、M－ODN 組和空白組明顯降低，而S－ODN 組、M－ODN 組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF 濃度未見(jiàn)明顯變化（表1）。

在相同的處理時(shí)間（48h），隨著加入AS－ODN濃度的增高，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞上清液中VEGF蛋白的分泌量逐漸降低，當(dāng)加入濃度為5.0μmol／L 的AS－ODN 作用血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞48h 時(shí)，分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF 濃度僅為空白對(duì)照組細(xì)胞的1／2（表2）。

3 討論

血管瘤是以血管內(nèi)皮細(xì)胞活躍增殖為特征的胚胎良性腫瘤，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管新生在血管瘤病理演變過(guò)程中起重要作用［8］，血管的新生是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞在VEGF等許多細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，發(fā)生增殖和遷移，形成血管瘤［9－10］，內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖，血管迅速生長(zhǎng)是血管瘤病理組織學(xué)的最大特點(diǎn)。

表1 5.0μmol／L各組寡核苷酸（SP－ODN）作用48h 后對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA 及VEGF蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）Table 1 The expression level of VEGF mRNA and protein in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with 5.0μmol／L SP－ODN for 48h（±s，n＝5）

表1 5.0μmol／L各組寡核苷酸（SP－ODN）作用48h 后對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA 及VEGF蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）Table 1 The expression level of VEGF mRNA and protein in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with 5.0μmol／L SP－ODN for 48h（±s，n＝5）

＊P＜0.05 vs.control group

GroupsVEGF mRNA（AVEGF／AGAPDH）VEGF protein（pg／mL）S－ODN 1.9±1.4 122.3±17.5 M－ODN 2.1±1.1 119.3±12.7 AS－ODN 0.5±0.1＊67.3±10.3＊Control 2.2±1.3 125.3.±17.6

表2 不同濃度AS－ODN 作用48h 后對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA 及VEGF蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）Table 2 The expression level of VEGF mRNA and protein in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with different concentrations of VEGF AS－ODN for 48h（±s，n＝5）

表2 不同濃度AS－ODN 作用48h 后對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA 及VEGF蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）Table 2 The expression level of VEGF mRNA and protein in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with different concentrations of VEGF AS－ODN for 48h（±s，n＝5）

＊P＜0.05 vs.control group（0μmol／L）

AS－ODN（μmol／L）VEGF mRNA（AVEGF／AGAPDH）VEGF protein（pg／mL）0 2.1±1.3 134.3±12.1 2.5 1.8±1.1 101.4±11.6 5.0 0.5±0.3＊67.1±9.3＊10.0 0.4±0.4＊58.8±8.7＊15.0 0.3±0.2＊52.2±8.5＊

VEGF是目前所知作用最強(qiáng)的一種促血管生長(zhǎng)因子，是新生血管形成的中心調(diào)控因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原［11］。VEGF 具有5 種分子類(lèi)型（VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206），是由不同的外顯子剪切編碼產(chǎn)生。VEGF121為可溶性分泌蛋白，VEGF165 有50%以可溶性形式分泌到胞外，其余部分和細(xì)胞膜或基膜上肝素結(jié)合，VEGF189和VEGF206幾乎完全與細(xì)胞膜上的肝素分子結(jié)合，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，通過(guò)蛋白水解酶的調(diào)節(jié)作用，使其釋放出來(lái)［12］。目前，VEGF及其受體成為抗血管生成治療腫瘤的理想靶點(diǎn)。其治療途徑主要為以下3 方面：①抑制VEGF 的釋放；②中和剛釋放出的VEGF；③阻斷VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGFR 的結(jié)合，其中抑制VEGF 分泌已成為抗腫瘤血管新生的主要治療手段［13］。

反義寡核苷酸（AS－ODN）藥物現(xiàn)已被作為腫瘤基因治療一類(lèi)較有前途的新型藥物［14－15］，其作用原理是通過(guò)堿基配對(duì)的原則與靶mRNA 結(jié)合，形成RNA－DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)，激活RNaseH，使靶RNA分子斷裂而失去功能，從而特異性抑制靶基因編碼的蛋白表達(dá)［16］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)VEGF AS－ODN 不僅能夠下調(diào)體外培養(yǎng)的乳腺癌和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)，而且能夠抑制體內(nèi)乳腺癌和眼脈絡(luò)膜的血管新生［17－18］。文獻(xiàn)報(bào)道VEGF AS－ODN 已成功用于抑制黑色素瘤、Kaposi肉瘤［7，19］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，AS－ODN 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，且這種增殖抑制作用呈嚴(yán)格的核苷酸序列依賴性、劑量依賴性和時(shí)間依賴性，并提示VEGF AS－ODN 抑制了VEGF 基因的表達(dá)［5］。為了更進(jìn)一步研究其作用途徑，本研究采用RT－PCR，半定量測(cè)定各組皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF mRNA 含量的變化，ELISA 檢測(cè)各組皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白分泌的改變。結(jié)果顯示，皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)516bp（VEGF121）和648 bp（VEGF165）2個(gè)片段，主要以VEGF121表達(dá)為主。VEGF121 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平明顯下降，且呈劑量依賴性減少，可見(jiàn)VEGF AS－ODN 能夠特異性抑制VEGF mRNA 表達(dá)。另外，ELISA 結(jié)果也顯示，VEGF AS－ODN 作用后，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF 蛋白的表達(dá)和分泌下降，隨著加入VEGF AS－ODN 濃度的增高，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞上清液中VEGF蛋白的分泌量逐漸降低，表明血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGF 可能以分泌型蛋白為主，這與RTPCR 檢測(cè)出血管瘤細(xì)胞主要表達(dá)VEGF121（516 bp）和VEGF165（648bp）2種mRNA 片段的結(jié)果相符。進(jìn)一步證實(shí)了VEGF AS－ODN 通過(guò)減少血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞分泌型VEGF蛋白的表達(dá)和分泌，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而發(fā)揮抗血管新生作用。

盡管VEGF AS－ODN 在腫瘤基因治療中取得了一定的療效，但也存在著明顯的不足，AS－ODN不能與所有的VEGF mRNA 結(jié)合，即其抑制作用并不完全。而且腫瘤的血管形成受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，單一抑制VEGF的表達(dá)并不能達(dá)到完全抑制腫瘤血管形成的目的。另外，抗血管生成只能抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，不能達(dá)到消滅腫瘤細(xì)胞的目的［20］，因此，合理利用反義核酸技術(shù)改變皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)行為，同時(shí)聯(lián)合其他傳統(tǒng)治療手段，是血管瘤基因治療的一個(gè)重要方向，值得進(jìn)一步研究探索。

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