坎地沙坦對糖尿病腎病大鼠足細胞Nephrin、Podocin和CD2AP表達的影響

李秋月， 李六生， 李桂霞， 周 靜， 呂金雷

1 南昌大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南昌 330006

2 南昌大學醫(yī)學院圖書館，南昌 330006

糖尿病腎?。―N）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，早期干預治療對延緩糖尿病腎病的進展有重要作用。研究表明足細胞損傷在糖尿病腎病發(fā)病機制中起十分重要作用［1］，Nephrin、Podocin、CD2 相關(guān)蛋白（CD2AP）是足細胞裂孔膜上重要的跨膜糖蛋白，在維持足突裂孔膜結(jié)構(gòu)完整中共同起重要作用，參與腎小球濾過屏障的形成并維持其正常功能［2］。因此，防止足細胞損傷是防治糖尿病腎病、腎功能損害的重要環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD 大鼠36 只，體重200～300g，由南昌大學醫(yī)學院動物科學部提供。1.1.2 試劑與儀器 坎地沙坦（Candesartan，重慶圣華曦藥業(yè)有限公司提供），鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司提供），Trizol試劑（美國Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大MBI Fermentas公司），DNA 純化試劑盒、Nephrin、Podocin、CD2AP 及βactin試劑及引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），PCR 熱循環(huán)儀（日本Techne公司）。

1.2 實驗動物分組

SD 大鼠36只，隨機分為3組，每組12只：A 組為正常對照組，B 組為DN 組，C 組為DN＋坎地沙坦組。B、C組給予高糖高脂飲食1個月后，于尾靜脈注射STZ，以隨機血糖≥16.7mmol／L 為糖尿病大鼠模型制備成功。于糖尿病模型成模1周后將3組大鼠分別置入代謝籠中喂養(yǎng)，C 組給予坎地沙坦5mg／（kg·d）灌胃，A 組及B組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 標本收集與處理

各組大鼠于用藥的第4周和第7周代謝籠收集24h尿液，用磺基水楊酸法檢測24h尿蛋白定量，全自動生化分析儀檢測血肌酐、尿肌酐，并根據(jù)以下公式計算Ccr：Ccr＝［尿肌酐濃度（μmol／L）×每分鐘尿量（mL／min）］／［血肌酐濃度（μmol／L）×體重（kg）］

1.4 RT－PCR檢測Nephrin、Podocin及CD2AP mRNA的水平

采用Trizol法，取腎組織100mg加1mL Trizol Reagent，勻漿后加入200μL 氯仿，離心后吸取上清，加入500μL異丙醇，離心沉淀后棄上清，70%乙醇洗沉淀，將RNA 溶于DEPC水，用紫外線分光光度計測定RNA 濃度及純度。擴增引物序列如下：Nephrin 上游引物5′－CGGAGAAGACTGAGGCGC－3′，下游引物5′－TCACACCAGATGTCCCCTCAG－3′；Podocin 上游引物5′－TCTTGTCCTCTCCTCCCTGA－3′，下游引物5′－AGACGGAGGTCAACCTTGTG－3′；CD2AP 上游引物5′－GCTGGTGGAAAGGTGAACTG－3′，下游引物5′－CATCTCTGTCTTCCGCCTTC－3′；β－actin 上游引物5′－CCAACCGTGAAAAGATGACC－3′，下游引物5′－CGAGAGGAGCAATGATCTTG－3′。Nephrin、Podocin和CD2AP的擴增體系如下：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）4 μL，10×Buffer 1.8 μL，dNTP（10 mm／L）0.4μL，引物（10pmol／μL）lμL，Taq DNA聚合酶1μL，反應總體系20μL。Nephrin 反應條件：95℃預變性5min，然后95℃10s，55℃退火30 s，72℃延伸l min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，擴增片段長度459bp；Podocin反應條件：95℃預變性10min，然后95℃45s，60℃退火45s，72℃延伸l min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，擴增片段長度195bp；CD2AP 反應條件：95℃預變性10min，然后95℃45s，60℃退火45s，72℃延伸l min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，擴增片段長度192bp。PCR 產(chǎn)物4℃保存。將PCR 產(chǎn)物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，30 min后紫外光燈下觀察結(jié)果。將電泳后的凝膠放于Image tool圖像處理系統(tǒng)獲得各自產(chǎn)物的吸光度值，目的基因吸光度與內(nèi)參照β－actin吸光度的比值即為目的基因mRNA 的半定量值。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及生化指標變化

4周時，與A 組相比，B 組大鼠血糖和24h 尿蛋白定量均明顯升高，Ccr下降，體重減輕（均P＜0.05）；與B組相比，C組的24h尿蛋白定量減少（P＜0.05），Ccr無明顯差異（P＞0.05）。7周時，與A組相比，B組大鼠血糖、24h尿蛋白定量明顯升高，Ccr下降，體重減輕（均P＜0.05）；與B 組相比，C組的24h尿蛋白定量減少，Ccr升高，體重增加（均P＜0.05）。見表1、表2。

表1 4周時各組大鼠生化指標檢測結(jié)果（±s，n＝12）Table 1 The biochemical results in different groups at the 4th week（±s，n＝12）

表1 4周時各組大鼠生化指標檢測結(jié)果（±s，n＝12）Table 1 The biochemical results in different groups at the 4th week（±s，n＝12）

＊P＜0.05 vs.group A；＃P＜0.05 vs.group B

Groups Weight（g）GLU（mmol／L）Proteinuria（mg／24h）Ccr（mL／min）A 241.22±21.24 6.38±0.92 7.00±0.59 1.75±0.34 B 199.41±15.54＊ 22.62±3.54＊ 28.67±3.83＊ 1.65±0.12＊C 212.74±23.19＊ 22.03±2.20＊ 24.00±3.68＊＃ 1.62±0.19＊

表2 7周時各組大鼠生化指標檢測結(jié)果（±s，n＝12）Table 2 The biochemical results in different groups at the 7th week（±s，n＝12）

表2 7周時各組大鼠生化指標檢測結(jié)果（±s，n＝12）Table 2 The biochemical results in different groups at the 7th week（±s，n＝12）

＊P＜0.05 vs.group A；＃P＜0.05 vs.group B

Groups Weight（g）GLU（mmol／L）Proteinuria（mg／24h）Ccr（mL／min）A 271.50±29.91 6.32±0.97 9.40±0.81 1.85±0.54 B 179.50±19.84＊ 23.83±2.40＊ 49.33±6.86＊ 1.08±0.43＊C 231.33±12.56＊＃23.30±2.35＊ 22.67±6.68＊＃ 1.50±0.27＊＃

2.2 各組大鼠Nephrin、Podocin和CD2AP mRNA半定量分析

將各組大鼠腎皮質(zhì)組織勻漿后抽提其mRNA，用RT－PCR 方法測定Nephrin、Podocin和CD2AP mRNA 水平，其結(jié)果B 組條帶亮度均低于A 組，C組經(jīng)坎地沙坦干預治療7周后，條帶亮度逐漸增強。計算機定量分析后顯示，與A 組比較，B 組Nephrin、Podocin 和CD2AP mRNA 表達下調(diào)（均P＜0.05）；與B 組比較，C 組Nephrin、Podocin 和CD2AP mRNA 表達上調(diào)（均P＜0.05）。見表3和圖1。

表3 7周時各組大鼠Nephrin、Podocin和CD2AP的吸光度值（±s，n＝12）Table 3 The Avalues of Nephrin，Podocin and CD2AP in different groups at 7th week（±s，n＝12）

表3 7周時各組大鼠Nephrin、Podocin和CD2AP的吸光度值（±s，n＝12）Table 3 The Avalues of Nephrin，Podocin and CD2AP in different groups at 7th week（±s，n＝12）

＊P＜0.05 vs.group A；＃P＜0.05 vs.group B

Groups Nephrin Podocin CD2AP A 1.085±0.106 0.765±0.094 0.873±0.123 B 0.575±0.184＊ 0.460±0.090＊ 0.617±0.116＊C 0.892±0.169＃ 0.667±0.121＃ 0.768±0.088＃

圖1 RT－PCR 方法檢測各組大鼠Nephrin、Podocin、CD2AP mRNA 水平Fig.1 The expression levels of Nephrin，Podocin and CD2AP mRNA in different groups

2.3 各指標的相關(guān)性分析

2.3.1 24h 尿蛋白定量與Nephrin、Podocin 和CD2AP相關(guān)分析 采用直線相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)，24h時尿蛋白定量與腎組織Nephrin（r＝－0.48，P＜0.01）、Podocin（r＝－0.36，P＜0.01）和CD2AP（r＝－0.29，P＜0.01）表達呈負相關(guān)。見圖2。

圖2 24h尿蛋白定量與Nephrin、Podocin和CD2AP相關(guān)分析Fig.2 Relationship between 24hurinary protein and Nephrin，Podocin，CD2AP

2.3.2 Ccr與Nephrin、Podocin和CD2AP相關(guān)分析 采用直線相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)，Ccr 與腎組織Nephrin（r＝0.67，P＜0.01）、Podocin（r＝0.50，P＜0.05）和CD2AP（r＝0.48，P＜0.05）表達呈正相關(guān)。見圖3。

圖3 Ccr與Nephrin、Podocin和CD2AP相關(guān)分析Fig.3 Relationship between Ccr and Nephrin，Podocin，CD2AP

3 討論

糖尿病腎病（DN）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，也是終末期腎衰竭的主要病因［3］，糖尿病腎病蛋白尿的產(chǎn)生與腎小球濾過屏障的結(jié)構(gòu)遭到破壞和（或）功能損傷有著十分密切的關(guān)系。腎小球濾過膜由臟層上皮細胞、基底膜（GBM）和內(nèi)皮細胞組成，臟層上皮細胞即足細胞，構(gòu)成防止蛋白丟失的最后一道屏障。2011年國際足細胞會議上有專家提出受損脫落的足細胞可能由腎小球Bowman囊壁層上皮細胞（PEC）延伸替代，楊婷等［4］發(fā)現(xiàn)PEC在局灶節(jié)段腎小球硬化、糖尿病腎病、IgA 腎病、缺血性腎病等疾病中有明顯的增生分層。足細胞損傷與糖尿病腎病蛋白尿產(chǎn)生及腎小球硬化有關(guān)［5－6］。相鄰足突之間的裂孔，由Nephrin、Podocin、CD2AP、FAT 和ZO－1等多種蛋白質(zhì)分子（又稱為裂孔膜分子或裂孔膜蛋白復合體）相連接，從而能阻止大分子物質(zhì)通過，使得腎小球濾過膜對血漿中物質(zhì)的通透具有高度選擇性。足細胞裂孔隔膜上足細胞相關(guān)蛋白如Nephrin與Podocin表達及分布異常是糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生的重要機制［7－8］。Fukasawa等［9］研究認為，裂孔膜蛋白可緊密連接足突和基底膜，使其不易從基底膜上脫落，而且足細胞還幫助基底膜清除免疫復合物和包曼氏囊內(nèi)其他大分子物質(zhì)［10］。Nephrin是一種跨膜蛋白，特異性表達在裂孔膜上，是裂孔膜蛋白復合體的主要成分，在糖尿病腎病的起始階段，肥大的腎小球和Nephrin的低表達和蛋白尿密切相關(guān)［11］。Podocin也是一種跨膜蛋白，屬Stomatin家族，原位雜交顯示編碼Podocin 的基因NPHS2幾乎全部表達在腎小球足細胞，而不在其他組織部位表達［12］。Nephrin和Podocin表達下調(diào)所致足細胞的損害不僅和蛋白尿的程度有關(guān)，也與腎小球硬化癥的進展和腎功能的損害有關(guān)［13］。CD2AP不僅在腎小球足細胞上有表達，在腎小管上皮細胞處也有微弱表達［14］。以上三者可能形成脂筏樣結(jié)構(gòu)發(fā)揮功能復合體的作用以維持裂孔膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，且可促進或放大Nephrin誘導的信號傳導［15］。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者腎小球Nephrin 表達減少，引起足細胞損傷脫落，濾過屏障功能破壞，通透性增加，尿蛋白排出增加［16］。Wang等［17］通過檢測糖尿病腎病患者尿沉渣中足細胞相關(guān)分子（Nephfin、Podocin 和Synaptopodin），發(fā)現(xiàn)其表達升高，應用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）治療后，尿液沉渣中Nephrin 排泄減少，且尿液中Podocin表達的改變可能與糖尿病腎病預后有關(guān)［18］。

本實驗結(jié)果顯示，糖尿病腎病大鼠足突間裂孔膜分子Nephrin、Podocin和CD2AP mNRA 表達均下調(diào)，一方面可能引起裂孔膜蛋白質(zhì)復合體的組成發(fā)生改變，足突間的分子連接減少或中斷，導致足突形態(tài)改變和產(chǎn)生蛋白尿；也有可能是高糖使足突融合甚至消失后，Nephrin、Podocin和CD2AP在足細胞表面的分布減少導致蛋白尿排泄增多；另一方面，Nephrin、Podocin在腎組織表達下調(diào)，使得細胞外到細胞內(nèi)CD2AP及細胞骨架蛋白的信號傳遞發(fā)生障礙，足細胞結(jié)構(gòu)進一步破壞，同時足細胞與基底膜相互作用減弱，鉚釘于腎小球基底膜的足細胞松動，甚至從基底膜剝離、脫落，濾過膜的完整性遭到破壞導致蛋白尿產(chǎn)生。有研究證明，尿蛋白排泄量與足細胞數(shù)、Nephrin表達呈負相關(guān)，與足突寬度及血清肌酐濃度呈正相關(guān)［19］。本組研究對尿蛋白排泄量、肌酐清除率與足細胞相關(guān)分子多個定量參數(shù)表達等的相關(guān)性進行了分析發(fā)現(xiàn)，24h尿蛋白排泄量與腎組織Nephrin、Podocin、CD2AP 表達呈負相關(guān)，肌酐清除率與Nephrin、Podocin和CD2AP 表達呈正相關(guān)，說明足細胞作為腎小球濾過膜的重要結(jié)構(gòu)和功能單位，在腎臟病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

坎地沙坦作為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）除了能夠改善糖尿病腎病血流動力學外，還可通過多種途徑保護腎功能。大量證據(jù)已經(jīng)證明，ARB類能夠通過阻斷腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)從而減少糖尿病腎病尿蛋白排泄；此外，Mifsud等［20］研究發(fā)現(xiàn)Valsartan和Irbesartan可通過阻止Nephrin表達下調(diào)，從而減少蛋白尿，坎地沙坦是否具有同樣的作用目前未見相關(guān)公開報道。我們采用坎地沙坦干預后，其結(jié)果表明坎地沙坦在阻止Nephrin mRNA 表達下調(diào)的作用與Valsartan等類似，此外坎地沙坦還能上調(diào)Podocin和CD2AP mRNA 在足細胞上的表達，提示坎地沙坦減輕糖尿病腎病蛋白尿的作用機制之一可能是通過上調(diào)足細胞相關(guān)分子的表達而實現(xiàn)的。另外我們發(fā)現(xiàn)4周和7周時B、C組血糖水平無明顯差異，因而認為坎地沙坦對大鼠腎臟保護作用與調(diào)節(jié)糖代謝無關(guān)。

本研究證實了坎地沙坦能通過增加Nephrin、Podocin和CD2AP的表達阻止甚至逆轉(zhuǎn)足細胞損傷，減少蛋白尿以減輕腎小球硬化及腎臟纖維化進程，從而有效地保護腎功能，改善糖尿病腎病的預后。

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