自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植加動員在重癥急性胰腺炎大鼠胰腺保護(hù)中的作用

項愛齋 蔡 陽 封光華 陸 貝 單毓強(qiáng) 賈 忠 楊祺俊 方 欣

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是常見高危急腹癥之一，其早期主要的病生理特點(diǎn)是胰腺細(xì)胞的凋亡、壞死和全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，可導(dǎo)致多臟器功能衰竭甚至死亡。目前，治療上仍缺乏特異有效的手段來控制早期炎癥級聯(lián)反應(yīng)阻止病程的進(jìn)展。近幾年對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)的研究發(fā)現(xiàn)其有組織修復(fù)、抗炎和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的功能，為SAP早期治療帶來了新希望。本研究擬觀察大鼠自體MSC移植和動員對SAP胰腺的保護(hù)作用［1～3］。

材料與方法

1．材料:清潔級的健康雄性 Sprague－Dawley大鼠240只，體重270～330g，購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。L－精氨酸、戊巴比妥鈉購自 Sigma公司(Sigma－Aldrich，St．Louis，MO，USA)。兔抗鼠 Bax、Bcl－2抗體購自 Santa公司(Santa Cruz，California，USA)。TUNEL試劑盒購自 Takara公司(Jindu，Japan)。粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte－Colony Stimulating Factor，G－CSF)購自齊魯制藥有限公司。

2．動物分組與模型建立:SD大鼠240只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、干細(xì)胞移植組(MSC)、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子組(G－CSF)及MSC+G－CSF組(n=48)，各組再按術(shù)后時間隨機(jī)分為12、24、48、72h亞組(n=12)。大鼠術(shù)前12h禁食，自由飲水。用2．5%戊巴比妥鈉(0．2ml/100g)經(jīng)腹腔內(nèi)注射麻醉。剪開股部皮膚暴露股靜脈，建立股靜脈輸液通道，用微量輸液泵持續(xù)輸液［1ml/(h·100g)］。通過2次腹腔注射L－精氨酸2．0g/kg(濃度20g/L，間隔1h)制作SAP模型。MSC組在造模前3天采集自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，造模后6h經(jīng)股靜脈一次性注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液1．2ml，G－CSF組在造模前3天分別皮下注入G－CSF液40μg/(kg·d)。假手術(shù)組僅腹腔注射等體積生理鹽水。

3．自體骨髓干細(xì)胞采集和靜脈回輸:在無菌條件下行股骨穿刺抽取骨髓，立即1000r/min離心10min后棄上層液體，無菌PBS緩沖液離心洗滌3次棄上清，細(xì)胞沉淀以PBS混勻后疊加于2倍體積淋巴細(xì)胞分離液上2500r/min離心30min，收集骨髓單核細(xì)胞層再用PBS洗滌2次。利用密度梯度離心技術(shù)收集骨髓單核細(xì)胞，洗滌后鋪板培養(yǎng)，根據(jù)MSC與造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)貼壁性能的差異將兩類細(xì)胞分離。將上述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以約1ml PBS液懸浮，備用經(jīng)股靜脈回輸［4］。

4．死亡率及胰腺病理變化的觀察:記錄各組的死亡率，直到各組對應(yīng)的觀察時間結(jié)束。觀察大鼠胰腺大體及光鏡下的病理改變，主要觀察有無水腫、出血、細(xì)胞壞死和間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤及各自程度，按照Kusser方法進(jìn)行評定，各項分值均為0～4分，總分0～16分［5］。

5．胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)和腺泡細(xì)胞Bax蛋白測定:對胰腺組織切片進(jìn)行DNA缺口原位末端標(biāo)記(TUNEL)染色，高倍鏡下(400倍)隨機(jī)選取10個視野，計數(shù)1000個腺泡細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)(AI=視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%)。Bax蛋白測定采用SABC免疫組化染色，具體操作參照試劑盒說明書。結(jié)果判定:利用圖像分析系統(tǒng)分析陽性面積和陽性區(qū)域平均灰度值，并將陽性面積和平均灰度值換算成陽性單位(positive unit，PU)，以PU值大小定量。

6．血清 TNF－ α、IL －6、AMS、CRP 水平的檢測:在全自動生化分析儀上進(jìn)行檢測，具體操作參照試劑盒說明書。

結(jié) 果

1．死亡率比較:假手術(shù)組大鼠全部存活，模型組48、72h死亡率分別為8．3%和33．3%。MSC組、G －CSF組和MSC+G－CSF組48h前未見死亡，72h死亡率分別為8．3%、16．7%和8．3%，與模型組比較差異無顯著性(P ＞0．05)。

2．胰腺組織病理改變比較:假手術(shù)組胰腺大體標(biāo)本無明顯改變，鏡下胰腺細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)大多正常，未見實(shí)質(zhì)出血、壞死和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤。模型組大體6h即可見胰腺腫脹，并有散在小出血點(diǎn)和灰黑色壞死灶;光鏡下6h可見胰腺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張、實(shí)質(zhì)出血，胰腺腺泡細(xì)胞和脂肪細(xì)胞散在變性、壞死，且隨時間延長逐漸加重。MSC組、G－CSF組和MSC+G－CSF組各時間點(diǎn)病理改變較模型組不同程度減輕，以MSC+G－CSF組改變最輕。具體評分見表1。

3．胰腺Bax蛋白表達(dá)水平和凋亡指數(shù)(AI)的比較:治療組各時間點(diǎn)Bax蛋白表達(dá)水平和AI均較模型組上調(diào)(P ＜0．05)。MSC+G －CSF 組24、48、72h點(diǎn)Bax蛋白含量，48、72h點(diǎn)AI與MSC組、G－CSF組比較差異顯著(p＜0．05)。MSC組和G－CSF組各時間點(diǎn)比較無顯著差異(P＞0．05)，見表2、表3。

表1 胰腺病理評分比較(n=12)

表1 胰腺病理評分比較(n=12)

與模型組比較，*P ＜0．05;與 MSC 組比較，#P ＜0．05;與 G －CSF組比較，△P ＜0．05

病理評分12h 24h 48h 72h假手術(shù)組 0．00 ±0．00* 0．95 ±0．20* 1．10 ±0．55* 1．35 ±0．45組別*模型組 10．72 ±1．31 12．08 ±1．43 12．81 ±1．50 14．95 ±1．52 MSC 組 9．04 ±1．50* 11．40 ±1．05* 11．94 ±1．21* 12．53 ±1．06*G －CSF 組 9．20 ±1．36* 11．83 ±1．07* 12．05 ±1．15* 12．84 ±1．35*MSC+G －CSF 組 9．10 ±0．95* 10．06±1．04* 10．83±0．98＊△ 10．35 ±1．45*#△

表2 各組胰腺Bax蛋白表達(dá)水平的比較)(n=12)

表2 各組胰腺Bax蛋白表達(dá)水平的比較)(n=12)

與模型組比較，*P ＜0．05;與 MSC 組比較，#P ＜0．05;與 G －CSF組比較，△P ＜0．05

12h 24h 48h 72h假手術(shù)組 3．07 ±0．23* 3．11 ±0．19* 2．98 ±0．26* 3．10 ±0．28組別 Bax(PU)*模型組 10．74 ±0．43 10．93 ±0．38 9．64 ±0．27 7．58 ±0．65 MSC 組 15．78 ±1．13* 13．88 ±1．35* 13．07 ±1．56* 10．42 ±1．34*G －CSF 組 15．65 ±2．27* 13．85 ±1．79* 12．95 ±1．37* 10．73 ±1．35*MSC+G －CSF 組 15．73 ±1．45* 15．60 ±1．25*#△ 15．69 ±1．72*#△ 13．73 ±1．32*#△

表3 各組胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(n=12)

表3 各組胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(n=12)

與模型組比較，*P ＜0．05;與 MSC 組比較，#P ＜0．05;與 G －CSF組比較，△P ＜0．05

12h 24h 48h 72h假手術(shù)組 0．87 ±0．13* 1．08 ±0．20* 0．94 ±0．17* 0．95 ±0．17組別 凋亡指數(shù)(AI)*模型組 7．64 ±1．45 4．71 ±1．07 3．85 ±0．81 3．02 ±0．67 MSC 組 14．82 ±1．93* 6．63 ±1．70* 5．25 ±0．98* 5．07 ±1．07*G －CSF 組 14．11 ±2．04* 6．08 ±1．21* 5．32 ±0．72* 4．89 ±0．63*MSC+G －CSF 組 15．01 ±1．39* 6．92 ±0．73* 6．69 ±0．94*#△ 6．33 ±1．01*#△

4．各組血清 TNF－α、IL－6、AMY、CRP 含量比較:模型組各指標(biāo)含量于造模24h后達(dá)到高峰。治療組各指標(biāo)含量隨時間延長有不同程度下降，24、48h后與模型組比較差異有顯著性(p＜0．05)。MSC+G－CSF組48、72h上述各指標(biāo)含量明顯低于MSC組和 G －CSF組(p＜0．05)，見表4。

表4 血清TNF－α、IL－6、AMY、CRP含量比較(n=12)

表4 血清TNF－α、IL－6、AMY、CRP含量比較(n=12)

與模型組比較，*P ＜0．05;與 MSC 組比較，#P ＜0．05;與 G －CSF組比較，△P ＜0．05

時間(h) 假手術(shù)組 模型組 MSC組 G－CSF組 MSC+G－CSF組12 45．1 ±3．8* 205．4 ±32．8 205．0 ±40．1 204．4 ±38．7 202．8 ±41．2 TNF－α(ng/L)IL－6(ng/L)AMY(U/L)CRP(mg/L)24 48．0 ±6．0* 231．3 ±33．1 210．3 ±30．6 211．2 ±32．3 202．5 ±31．7*48 43．5 ±4．1* 247．2 ±38．3 215．6 ±32．1* 216．8 ±31．3* 190．3 ±29．2＊△72 51．3 ±6．7* 237．1 ±35．5 204．2 ±31．0* 207．0 ±30．4* 178．7 ±28．9*#△12 158．7 ±20．8* 1224．1 ±180．6 1105．9 ±159．0 1101．4 ±172．1 1080．2 ±150．0*24 153．5 ±25．4* 1408．3 ±251．1 1224．1 ±170．6* 1222．1 ±175．4* 1215．3 ±172．1*48 160．1 ±21．5* 1374．5 ±198．7 1170．3 ±160．2* 1198．9 ±164．3* 1032．1 ±150．6*#△72 155．4 ±20．3* 1289．2 ±179．4 995．6 ±143．7* 1052．0 ±155．2* 861．4 ±140．9*#△12 690．7 ±101．4* 3706．9 ±982．7 3416．1 ±736．0 3846．7 ±834．3 3671．0 ±506．8 24 701．2 ±91．8* 5738．8 ±887．2 4502．1 ±954．9 4717．2 ±760．1 4016．9 ±485．2*48 687．6 ±99．3* 6084．2 ±1005．8 4102．4 ±854．7* 3905．7 ±683．1* 3074．3 ±503．1*#△72 697．3 ±105．1* 5436．0 ±658．3 3436．5 ±745．9* 3075．7 ±654．4* 2483．8 ±550．7*#△12 0．95 ±0．24* 4．70 ±2．52 2．93 ±1．82 3．03 ±2．05 1．76 ±0．65*24 1．01 ±0．31* 4．85 ±2．81 3．09 ±1．91 3．13 ±2．11 1．85 ±0．73*48 1．10 ±0．22* 5．43 ±2．74 3．21 ±2．28* 3．29 ±2．02* 1．90 ±0．71＊△72 1．06 ±0．27* 5．18 ±2．69 3．16 ±1．95* 3．20 ±2．06* 1．71 ±0．58*#△

討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)體外均有較強(qiáng)可塑性，在特定條件下可通過血液循環(huán)到達(dá)其他組織器官，并經(jīng)微環(huán)境誘導(dǎo)分化為不同胚層來源的組織細(xì)胞，參與組織器官的生理更新和病理損傷修復(fù)。目前，臨床上MSC已用于血液系統(tǒng)疾病、心臟衰竭、肝臟損傷、糖尿病等多種疾病的治療，并取得了確切的療效。MSC對SAP治療效果的研究主要來自于動物實(shí)驗(yàn)，在病理再生修復(fù)方面也得到了證實(shí)，如江學(xué)良等應(yīng)用核染料標(biāo)記胰腺炎大鼠自體MSC并跟蹤測定，在損傷的第2周觀察到MSC歸巢至損傷的胰腺組織并部分分化，在損傷后的第8周MSC轉(zhuǎn)化為成熟的胰腺功能細(xì)胞，證實(shí)其參與了胰腺細(xì)胞的病理再生，在胰腺損傷的后期修復(fù)中發(fā)揮了重要作用。另有一些研究表明，MSC還能通過分泌調(diào)節(jié)蛋白和細(xì)胞因子等發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和抑制炎癥反應(yīng)的作用，而炎癥級聯(lián)反應(yīng)是SAP早期(急性炎癥期)最主要的病生理過程，從而推斷MSC可能成為SAP早期一個新的特異有效的治療手段［6，7］。

本研究通過皮下注射G－CSF動員SAP大鼠的自體骨髓MSC，以及直接靜脈移植兩種方式，了解各自的治療療效，同時比較聯(lián)合與單獨(dú)治療的差異。結(jié)果顯示治療組中的MSC+G－CSF組大鼠72h死亡率較模型組和G－CSF組低，胰腺病理損害最輕，提示MSC有助于減輕SAP病情，降低死亡率。同時我們發(fā)現(xiàn)治療組能明顯上調(diào)胰腺腺泡細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)(p＜0．05)，且與凋亡指數(shù)變化正相關(guān)，表明MSC可能通過調(diào)節(jié)Bax蛋白的表達(dá)在SAP早期誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡不釋放炎癥介質(zhì)，與細(xì)胞壞死不同，對胰腺組織是一種保護(hù)作用。Lugea等［8］研究發(fā)現(xiàn)抑制胰腺腺泡細(xì)胞凋亡后，壞死細(xì)胞明顯增多，胰腺炎的嚴(yán)重程度加重，從反面也證實(shí)了凋亡在胰腺炎中對胰腺腺泡細(xì)胞的保護(hù)作用。3個治療組48、72h血清中 TNF－ α、IL －6、AMY、CRP 含量均下降，而TNF－α已有研究證實(shí)是SAP的始動因子，IL－6參與SAP的多臟器功能損害，說明MSC可通過抑制SAP早期的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，減輕胰腺和胰外組織細(xì)胞的損傷。

MSC組與G－CSF組對SAP的凋亡調(diào)控及炎癥抑制指標(biāo)無明顯差別，與文獻(xiàn)報道一致。我們認(rèn)為骨髓MSC移植和動員技術(shù)途徑不同但作用相似，GCSF也有促進(jìn)骨髓MSC增殖的效果，與Wexler的研究一致，但動員后外周血MSC含量是否和靜脈移植一樣穩(wěn)定未進(jìn)一步評估，且動員所需的時間偏長，在本實(shí)驗(yàn)中給予提前3天給藥，有一定的局限性。靜脈骨髓MSC移植技術(shù)操作上要求更高，優(yōu)點(diǎn)是在SAP后可以及時注射，迅速提高并穩(wěn)定外周血MSC濃度，節(jié)省動員等待期，在SAP早期即可發(fā)揮治療作用，較骨髓動員更具臨床治療意義。另外，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于單獨(dú)治療組，推測聯(lián)合治療不僅有利于促進(jìn)MSC量的表達(dá)，甚至還可能與G－CSF同時動員其他類型干細(xì)胞有關(guān)。有研究顯示，骨髓中存在CD34+的原始造血干細(xì)胞，具有更強(qiáng)大的自我更新和分化潛能，可能是HSC、MSC和EPC的共同譜系祖先，在一定微環(huán)境下可以轉(zhuǎn)化為組織細(xì)胞［9］。通過本研究我們看到了骨髓干細(xì)胞對SAP胰腺損害保護(hù)作用確切，在SAP早期可提高胰腺細(xì)胞的凋亡及減少炎癥介質(zhì)的釋放，以及在其他研究中證實(shí)的病理再生修復(fù)特性，使MSC極有可能成為治療SAP的新希望。

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