靈芝多糖和當歸多糖促進人外周血T淋巴細胞增殖和分泌IFN-γ

耿衛(wèi)樸，徐 曼，羅 祎，王婷婷，黃文煉，陳 瑜

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.病理教研室，分子與腫瘤研究中心，2.附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016)

手術(shù)、放療和化療是目前臨床治療惡性腫瘤的常規(guī)治療方法，但放療和化療都有明顯的毒副作用。靈芝和當歸因無明顯毒副作用，有一定的“生血”和增強患者機體抵抗力效果，故常用于腫瘤患者的輔助治療［1］，但其作用機制尚不完全清楚。

靈芝多糖是靈芝(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)的水提取物中主要的活性成分，體內(nèi)外實驗證明它對抗原遞呈細胞、單核巨噬細胞系統(tǒng)以及體液免疫和細胞免疫均有調(diào)節(jié)作用，尤其通過促進T細胞功能而增強實驗小鼠機體的抗腫瘤效應(yīng)［2-4］;文獻報道靈芝多糖促進 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞增殖，還促進淋巴細胞的細胞因子基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，尤其是Th1類細胞因子IFN-γ和IL-12的表達。此外，靈芝多糖還有助于 γ射線損傷T細胞的修復(fù)［5］。當歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)是當歸水溶性提取物。文獻報道當歸提取物能促進PI3K/ALT信號通路，該作用可能參與抑制小鼠外周血細胞的凋亡;此外，它還促進小鼠脾臟T細胞增殖、抑制移植性腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存時間［6-7］。因PI3K/Akt信號途徑在T細胞增殖中發(fā)揮重要作用，而Caspase-3是細胞凋亡信號途徑的效應(yīng)分子，本研究采用免疫熒光染色、流式細胞術(shù)、MTT和ELISA方法觀察了靈芝多糖和當歸多糖對人外周血活化T細胞PI3K和Caspase-3蛋白表達及T細胞增殖、凋亡和分泌細胞因子的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 新鮮人外周血取自健康獻血者;人淋巴細胞分離液為天津灝洋生物公司產(chǎn)品;尼龍毛為德國KISKER公司產(chǎn)品;RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品;小牛血清和胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;靈芝多糖和當歸多糖為陜西慈緣生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;PHA和MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品;細胞增殖試劑盒為南京凱基生物公司產(chǎn)品;IFN-γ試劑盒為美國RD公司產(chǎn)品;鼠抗人PI3K和Caspase-3抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備集團公司，蘇州)，CO2細胞培養(yǎng)箱(SHEL-LAB公司，美國)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)，流式細胞儀(Beckman Coulter XL公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 健康人外周血T細胞的分離活化和培養(yǎng)新鮮抗凝外周血梯度離心后吸取單個核細胞，再經(jīng)尼龍毛柱獲得T淋巴細胞。將T淋巴細胞分為對照組、靈芝多糖組和當歸多糖組，在含PHA(10 mg·L-1)的RPMI 1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，各組分別加入PBS、靈芝多糖(100 mg·L-1)和當歸多糖(100 mg·L-1)培養(yǎng)1、2、24、72 h后進行后續(xù)實驗。每組實驗分別重復(fù)3次。

1.2.2 免疫熒光觀察各組T細胞PI3K和Caspase-3蛋白表達 T淋巴細胞培養(yǎng)1、2和24 h后細胞涂片及10%甲醛固定后，分別加入鼠抗人PI3K抗體(1∶50)和Caspase-3抗體(1∶50)4℃冰箱孵育過夜，F(xiàn)ITC標記抗鼠抗體(1∶50)37℃避光孵育1 h后，PBS清洗并用甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 MTT檢測T細胞增殖 將對照組、靈芝多糖組和當歸多糖組T細胞分別培養(yǎng)72 h并接種于96 孔板(每孔100 μl，細胞數(shù)1×108·L-1)，每組設(shè)3個復(fù)孔。每孔加入MTT溶液10 μl(5 g·L-1)培養(yǎng)4 h后，離心后吸去上清并加入二甲基亞砜(60 μl/孔)，低速震蕩10 min，酶標儀490 nm測量各孔吸光度值(OD值)。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測T細胞的細胞周期和凋亡率 收集上述各組培養(yǎng)72 h的T淋巴細胞，經(jīng)體積分數(shù)為0.70的乙醇固定24 h后，流式細胞術(shù)檢測T細胞的細胞周期和凋亡率。

1.2.5 ELISA檢測T細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ含量 分別收集對照組、靈芝多糖組和當歸多糖組T細胞培養(yǎng)72 h的上清液，按ELISA試劑盒說明書操作檢測各組T淋巴細胞的IFN-γ含量。

1.2.6 圖像分析和統(tǒng)計學(xué)方法 采用圖像分析系統(tǒng)(Imagepro-Plus)對免疫熒光染色陽性強度進行分析。隨機選5個高倍視野測量PI3K和Caspase-3的平均光密度，計算出平均值。采用SPSS 17.0軟件計算各組數(shù)據(jù)的均數(shù)與標準差，實驗結(jié)果以±s表示，t檢驗比較實驗組與對照組間的差異。

2 結(jié)果

2.1 靈芝多糖和當歸多糖對T細胞PI3K表達和T細胞增殖的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示空白對照組、靈芝多糖組及當歸多糖組T細胞培養(yǎng)1、2及24 h后細胞內(nèi)均表達PI3K蛋白，但各組間平均光密度值無明顯差別。MTT實驗結(jié)果顯示空白對照組、靈芝多糖組及當歸多糖組T細胞增殖的OD值如表1，靈芝多糖組、當歸多糖組與空白對照組間差異均有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)。

2.2 靈芝多糖和當歸多糖對T細胞生長周期的影響 正常人外周血T細胞與靈芝多糖和當歸多糖混合培養(yǎng)72 h后，各組細胞的G1、G2/M期及S期分布無差別。

2.3 靈芝多糖和當歸多糖對Caspase-3蛋白表達及凋亡的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示空白對照組和當歸多糖組培養(yǎng)24 h后T細胞Caspase-3蛋白表達的平均光密度值分別為0.51±0.24和0.46±0.22，兩組間差別無顯著性;而靈芝多糖組T細胞Caspase-3蛋白表達的平均光密度值為0.38±0.16，明顯低于空白對照組(P＜0.05)(Fig 1)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示空白對照組和當歸多糖組T細胞凋亡率分別為29.74%和29.87%，兩組間差別無顯著性;而靈芝多糖組T細胞凋亡率為18.23%，明顯低于前兩組。

Tab 1 Proliferation of T lymphocytes which were cultured 72 h(±s)

Tab 1 Proliferation of T lymphocytes which were cultured 72 h(±s)

t=16.955，＊＊P=0.003＜0.01 vs blank control;t=6.634，*P=0.022＜0.05 vs blank control

Group Blank control GLP ASP OD value 0.36±0.04 0.55±0.02＊＊ 0.52±0.02*

Fig 1 The expression of Caspase-3 of T lymphocytes

2.4 靈芝多糖和當歸多糖對T細胞分泌IFN-γ的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示T細胞培養(yǎng)72 h后，空白對照組上清液中IFN-γ含量為(1850.09±93.34)ng·L-1，靈芝多糖組和當歸多糖組上清液中IFN-γ含量分別為(2071.41±166.40)ng·L-1和(2030.33±28.76)ng·L-1，均明顯高于空白對照組(P＜0.05，P＜0.05)(Fig 2)。

Fig 2 IFN-γ concentration in supernatant of T lymphocytes

3 討論

本實驗觀察到靈芝多糖和當歸多糖均促進人外周血T細胞PI3K的表達，使T細胞增殖水平明顯提高。PI3K在T細胞生存和增殖中的重要作用已得到研究者的證實，如 Hand等［8］發(fā)現(xiàn)無論記憶CD8+T還是效應(yīng)CD8+T細胞都依賴于PI3K而生存，Soond等［9］發(fā)現(xiàn)PI3K不僅參與初始T細胞的分化，還與其分泌IFN-γ有密切關(guān)系。但本實驗觀察到空白對照組的T細胞也表達蛋白激酶PI3K，這可能與該組T細胞培養(yǎng)液內(nèi)加入了具有刺激細胞增殖作用的PHA有關(guān)。Li等［10］還報道靈芝多糖可通過激活PKC和PKA激酶誘導(dǎo)小鼠脾臟CD4+T和CD8+T細胞增殖并促進細胞免疫，提示PI3K可能只是靈芝多糖刺激T細胞增殖的信號途徑之一。Liu等［11］報道當歸多糖也通過PI3K途徑促進小鼠造血干細胞增殖。當歸多糖還能促進小鼠脾細胞增殖，并刺激免疫功能低下小鼠的CD4+T細胞增生。我們對照觀察靈芝多糖、當歸多糖與對照組T細胞的細胞周期情況，結(jié)果3組間并無明顯差別，這可能與空白對照組培養(yǎng)液內(nèi)的PHA作為有絲分裂原也促進T細胞的細胞周期運行，但靈芝多糖和當歸多糖促進了更多的T細胞進入細胞周期有關(guān)。

本實驗還觀察到靈芝多糖和當歸多糖均能降低人外周血活化T細胞Caspase-3的表達，尤其是靈芝多糖下調(diào)Caspase-3表達和抑制T細胞凋亡的作用明顯。文獻報道腫瘤患者外周血T細胞Caspase-3高表達與 T細胞凋亡有密切關(guān)系［12］。Liu等［11］報道當歸多糖具有抑制小鼠造血干細胞凋亡的作用，但本實驗未發(fā)現(xiàn)其有抑制人外周血T細胞凋亡的作用，推測當歸多糖抗凋亡的作用可能在人和鼠之間存在差異。

本實驗還觀察到靈芝多糖和當歸多糖均明顯促進人外周血T細胞分泌IFN-γ。Gao等［13］證實靈芝多糖喂飼荷瘤小鼠明顯抑制了腫瘤的生長，體外實驗證實靈芝多糖不僅刺激了小鼠脾細胞的增殖，還促進了IFN-γ的分泌，T細胞的細胞毒作用也明顯增強。靈芝多糖促進小鼠脾細胞增殖及分泌IFN-γ與細胞內(nèi)GTP酶、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白等的活化，抑制凋亡相關(guān)蛋白如 CARD、β-actin，tubulin-α2，copine I和 γ-actin等活化有關(guān)［14］。我們推測本實驗中靈芝多糖和當歸多糖促進外周血T細胞分泌IFN-γ的作用可能與它們通過PI3K途徑促進T細胞增殖，下調(diào)細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3從而抑制T細胞凋亡的作用密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明當歸多糖和靈芝多糖具有促進人T細胞增殖和分泌IFN-γ的功能，靈芝多糖還具有抑制T細胞凋亡的作用。因此，靈芝多糖和當歸多糖具有確切的促進人外周血T細胞免疫的作用。

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