降膽固醇合生元組合的體外篩選

秦翠麗，劉文靜，王德舜，胡隨隨，張永柱，朱宇博，丁廣歌

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003）

動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病目前已成為威脅人類健康的第一大殺手。WHO認(rèn)為引發(fā)心腦血管疾病的主要原因之一就是高血脂癥[1]。臨床實(shí)踐表明，降低血清膽固醇濃度能夠顯著降低心腦血管病的死亡率[2]。因此，篩選降低血清中膽固醇水平的有效制劑，是當(dāng)前科研人員研究的熱點(diǎn)。

益生菌是一類能夠?qū)θ梭w健康起到促進(jìn)作用的活體微生物。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)其具有多種生物活性，降低血清膽固醇水平是其重要的生理活性之一[3-8]。益生元是可選擇性刺激益生菌生長并能對(duì)宿主產(chǎn)生健康效應(yīng)的物質(zhì)，在降低血脂和膽固醇方面也有一定功效[9]。而益生菌和益生元組成的新一代微生態(tài)調(diào)節(jié)劑——合生元，目前已成為益生菌保健應(yīng)用新的研究熱點(diǎn)。

國外資料表明，在降低血清膽固醇水平方面，使用合生元比單獨(dú)使用益生菌或益生元效果要好，能顯著降低血清膽固醇水平[10-12]。但目前國內(nèi)有關(guān)合生元組合降膽固醇的研究報(bào)道還很少。因此，篩選并優(yōu)化出具有降膽固醇功能的合生元組合，對(duì)于降低心腦血管病的發(fā)生具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嬰兒雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌：由河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基

PTYG：胰蛋白胨0.5%，酵母粉1.0%，葡萄糖1.0%，吐溫800.1%，大豆蛋白胨0.5%，無機(jī)鹽溶液4%，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05%（培養(yǎng)基煮沸后加入），pH7.0，瓊脂1.5%～2.0%以上，培養(yǎng)基（液體）在接種前煮沸驅(qū)氧后接種，于厭氧箱中培養(yǎng)。

無機(jī)鹽溶液（1 L）：CaCl2（無水）0.2 g，MgSO4·7H2O 0.48 g，K2HPO41.0 g，KH2PO 41.0 g，NaCl 2.0g，NaHCO310.0 g，混合CaCl2和MgSO4在300 mL蒸餾水中直至溶解，加500 mL蒸餾水，邊攪拌邊緩慢加入其他鹽類，繼續(xù)攪拌直至全部溶解，加200 mL蒸餾水混勻，保存到4℃下備用。

PTYG-膽固醇培養(yǎng)基：大豆蛋白胨0.5%、酵母浸粉1.0%、益生元1.0%、胰蛋白胨0.5%、吐溫800.1%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05%、無機(jī)鹽溶液4.0%、豬膽鹽0.3%、膽固醇終濃度為0.2m g/mL，pH7.0。

1.1.3 益生元

水蘇糖：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院；低聚異麥芽糖、低聚果糖：山東保齡寶生物技術(shù)有限公司；山梨醇：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；水解酪蛋白、膽固醇：上海藍(lán)秀科技發(fā)展有限公司。

1.1.4 儀器

miniMACS厭氧培養(yǎng)箱：英國DWS；紫外可見分光光度計(jì)（WFZ，UV2800AH型）：尤尼柯（上海）儀器有限公司；TG16-W微量高速臺(tái)式離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化

將嬰兒雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌分別接種于PTYG液體培養(yǎng)基，連續(xù)活化3次，每次厭氧培養(yǎng)24 h，使菌液終濃度為8×109CFU/mL和7.2×108CFU/mL。

1.2.2 單一益生元與單一益生菌降膽固醇合生元的組合篩選

將活化的嬰兒雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌分別按體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量分別接種到含有1%單一益生元——低聚異麥芽糖、酪蛋白、水蘇糖和山梨醇或葡萄糖的20 mL PTYG-膽固醇培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵液中膽固醇水平。以不添加益生元及葡萄糖、接種有等量益生菌的PTYG-膽固醇培養(yǎng)基作對(duì)照。

1.2.3 保加利亞乳酸菌與混合益生元合生元組合降膽固醇的篩選

將活化的保加利亞乳桿菌按體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量分別接種到含有1%混合益生元（質(zhì)量比1∶1）——低聚異麥芽糖+葡萄糖、低聚果糖+葡萄糖、低聚異麥芽糖+低聚果糖的20 mL PTYG-膽固醇培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵液中膽固醇水平。以不添加益生元及葡萄糖、接種有等量同種益生菌的PTYG-膽固醇培養(yǎng)基作對(duì)照。

1.2.4 嬰兒雙歧桿菌與混合益生元合生元組合降膽固醇的篩選

將活化的嬰兒雙歧桿菌分別按體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量分別接種到含有1%混合益生元（質(zhì)量比1∶1）——低聚異麥芽糖+葡萄糖、低低聚異麥芽糖+酪蛋白、低聚異麥芽糖+葡萄糖、山梨醇+酪蛋白、山梨醇+葡萄糖、酪蛋白+葡萄糖的20 mLO PTYG-膽固醇培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵液中膽固醇水平。以不添加益生元及葡萄糖、接種有等量同種益生菌的PTYG-膽固醇培養(yǎng)基作對(duì)照。

1.2.5 膽固醇含量測(cè)定

采用硫酸鐵銨顯色法測(cè)定膽固醇含量[13]。精確量取各個(gè)三角瓶的細(xì)菌發(fā)酵液0.1 mL，分別放入干燥潔凈的5 mL離心管中，再分別加入4.9 mL無水乙醇，混勻后進(jìn)行4000 r/min離心15 min；分別取各離心管上清液3.0 mL放入干燥潔凈試管，再沿試管壁緩慢加入3.0 mL硫酸鐵銨顯色液，振蕩混勻，待冷卻至室溫，測(cè)定其在560 nm處的吸光度。根據(jù)下列公式計(jì)算膽固醇去除率：

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以O(shè)D560±SD表示，并用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一益生元與單一益生菌降膽固醇合生元的組合篩選

單一益生元與單一益生菌合生元組合體外降膽固醇效果見表1。

表1數(shù)據(jù)說明：對(duì)于保加利亞乳桿菌，在添加葡萄糖、低聚異麥芽糖、酪蛋白、水蘇糖和山梨醇單一益生元時(shí)，發(fā)酵液膽固醇的去除率均高于對(duì)照組，分別為30.6%、26.6%、28.8%、7.9%、43.2%，去除率在7.9%～43.2%之間，其中保加利亞乳桿菌+山梨醇合生元組合去除膽固醇效果最為明顯，去除率高達(dá)43.2%，該組合基質(zhì)中膽固醇水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；而嬰兒雙歧桿菌與上述益生元組合去除率分別為25.0%、8.1%、18.3%、12.0%、20.8%，去除率在8.1%～25.0%之間，總體低于保加利亞乳桿菌。這一研究結(jié)果與于景華[14]等發(fā)現(xiàn)7株益生菌在純培養(yǎng)模型和發(fā)酵模型中均表現(xiàn)出不同的脫除膽固醇能力相吻合。

表1 單一益生元與單一益生菌合生元組合體外降膽固醇效果（OD560±SD）Table 1 Effect of single probiotic and prebiotic combination on cholesterol contents in vitro

實(shí)驗(yàn)組合生元組合的去除膽鹽能力高于對(duì)照組，且同一益生元與不同菌株構(gòu)成的合生元組合會(huì)表現(xiàn)出的不同降膽固醇作用，與益生元的促生長作用、相互間的協(xié)同作用以及不同合生元組合中菌株所產(chǎn)生的膽鹽水解酶的量與活性、細(xì)菌細(xì)胞壁吸附膽固醇、細(xì)菌細(xì)胞膜吸收膽固醇、細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)積累膽固醇的能力不同有關(guān)[15]。

但值得注意的是，并非所有益生元都能提高益生菌的去除膽固醇能力，在添加低聚果糖作為益生元時(shí)，保加利亞乳酸桿菌與嬰兒雙歧桿菌的膽固醇的去除率均為負(fù)值，即培養(yǎng)基中的膽固醇水平比試驗(yàn)前還要高，這種結(jié)果出現(xiàn)的原因待進(jìn)一步研究。

2.2 保加利亞乳桿菌與混合益生元降膽固醇合生元組合的篩選

保加利亞乳桿菌與混合益生元降膽固醇合生元組合體外試驗(yàn)效果見表2。

表2 混合益生元與保加利亞乳桿菌合生元組合體外降膽固醇效果(OD560±SD)Table 2 Effect of Bulgaria lactobacillus and mixed prebiotics combination on cholesterol contents in vitro

表2數(shù)據(jù)說明：在低聚異麥芽糖+葡萄糖混合益生元存在時(shí)，合生元組合去除膽固醇的能力高于對(duì)照組，但不顯著（P>0.05），僅為1.6%，比單獨(dú)添加聚異麥芽糖或葡萄糖的去除膽固醇能力都要弱許多；但在低聚異麥芽糖+低聚果糖、低聚果糖+葡萄糖混合益生元存在時(shí)，合生元組合不僅沒有去除膽固醇，能力反而低于對(duì)照組，且與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。這種情況的出現(xiàn)推測(cè)其原因是不同益生元同時(shí)存在時(shí)，相互之間出現(xiàn)干擾或抑制現(xiàn)象造成的。

2.3 嬰兒雙歧桿菌與混合益生元降膽固醇合生元組合的篩選

嬰兒雙歧桿菌與混合益生元合生元降膽固醇組合體外試驗(yàn)效果見表3。

表3 混合益生元與嬰兒雙歧桿菌合生元組合體外降膽固醇效果(OD560±SD)Table 3 Effect of B.infantis and mixed prebiotics combination on cholesterol contents in vitro

表3數(shù)據(jù)說明：山梨醇+酪蛋白混合益生元與嬰兒雙歧桿菌降膽固醇合生元組合的去除膽固醇效果最好，去除率為27.0%，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），且比任何單一益生元組合的去除率都高，這種情況的出現(xiàn)可能是山梨醇與酪蛋白不是同一類物質(zhì)的益生元，彼此之間的不會(huì)出現(xiàn)干擾或抑制現(xiàn)象，且與益生菌間有良好的協(xié)同作用、促進(jìn)膽鹽的水解酶的分泌或增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)膽鹽的吸收與積累。

在低聚異麥芽糖+山梨醇、山梨醇+葡萄糖、酪蛋白+葡萄糖混合益生元存在時(shí)，合生元組合的去除膽固醇的能力略高于對(duì)照組，去除率分別為2.1%、7.4%、3.7%，比單獨(dú)添加低聚異麥芽糖、山梨醇、酪蛋白或葡萄糖時(shí)的去除膽固醇能力要低許多；而在低聚異麥芽糖+酪蛋白、低聚異麥芽糖+葡萄糖混合益生元存在時(shí)，合生元組合去除膽固醇的能力反低于對(duì)照組，這些情況的出現(xiàn)，可能原因同2.2。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌合生元組合的降低膽固醇效果與益生菌、益生元種類和搭配有關(guān)。保加利亞乳桿菌降低膽固醇效果總體好于嬰兒雙歧桿菌，說明與菌株特異性有關(guān)[16]。在山梨醇存在條件下，保加利亞乳桿菌對(duì)膽固醇的去除率達(dá)到43.2%，效果顯著（P<0.05）；當(dāng)培養(yǎng)基中添加山梨醇+酪蛋白時(shí)，嬰兒雙歧桿菌對(duì)膽固醇的去除效果最好，去除率為 27.0%，效果顯著（P<0.05）。V.Mandal等[17]報(bào)道稱以P.acidilactici LAB 5+山梨醇喂食瑞士白化病老鼠可以顯著降低其血漿膽固醇水平，說明山梨醇對(duì)乳酸菌降膽固醇作用明顯。因此可以將保加利亞乳桿菌+山梨醇組合作進(jìn)一步優(yōu)化。

本研究還發(fā)現(xiàn)：凡添加低聚果糖的培養(yǎng)基，膽固醇水平均高于對(duì)照組，這與Liong等[18]體內(nèi)研究結(jié)果相反；益生元單獨(dú)添加和混合添加作用效果明顯不同，甚至出現(xiàn)相反的結(jié)果。這些均表明益生元對(duì)益生菌降膽固醇的作用復(fù)雜，詳細(xì)機(jī)制仍有待研究。

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