牛奶中煙酸本底含量的測(cè)定

劉志楠，李海礁，宋曉東，葉峰，喻東威，解鑫

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司質(zhì)量安全管理中心分析中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500）

牛奶是天然的全營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其微量元素的含量比較全面。早在1867年人們就在實(shí)驗(yàn)室中合成了煙酸，而其真正得到發(fā)展是始于20世紀(jì)30年代，1937年C.A.Elvehijiem等分離出煙酸，不久又在肝臟中獲得煙酞胺[1]，一時(shí)間作為醫(yī)藥產(chǎn)品得到了迅速發(fā)展，新的用途被不斷的開(kāi)發(fā)出來(lái)，其應(yīng)用領(lǐng)域筱蓋醫(yī)藥、食品、飼料添加劑及化工助劑等行業(yè)。煙酸即3—毗吮甲酸，又名尼可丁酸，是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、理化性質(zhì)最穩(wěn)定的一種維生素，是人體和動(dòng)物中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，它參與組織的氧化還原過(guò)程，具有促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝和擴(kuò)張血管的功能，能促進(jìn)人體和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[2-3]。煙酸不僅參與細(xì)胞內(nèi)呼吸過(guò)程而且在VB6、泛酸和生物素的存在下還參與脂肪蛋白質(zhì)和DNA的合成[4-5]，因此煙酸對(duì)人體有著重要的生理功能[6]。

關(guān)于水溶性維生素的檢測(cè)，以往文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要包括微生物、高效液相法、酶法和免疫法等[7-8]，依據(jù)國(guó)標(biāo)的方法，我們采用高效液相色譜法和微生物法對(duì)牛奶中的煙酸進(jìn)行檢測(cè)。但國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)對(duì)牛奶中煙酸本底含量的相關(guān)報(bào)道卻很少。針對(duì)這種現(xiàn)象，我們選取410份中國(guó)各地的牛奶樣本進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)，意在得出牛奶中煙酸含量的大致范圍，以指導(dǎo)乳制品企業(yè)在合理范圍內(nèi)強(qiáng)化煙酸的添加量。本研究參考了AOAC[9]的方法，并使用煙酸檢測(cè)試劑盒[10]使微生物檢測(cè)煙酸的方法有較大程度的優(yōu)化，使檢測(cè)時(shí)間有較大幅度的縮短。

為了評(píng)價(jià)食品標(biāo)簽上標(biāo)注成分的準(zhǔn)確性。美國(guó)食品和藥物管理局FDA規(guī)定維生素在食品中的實(shí)際添加量必須為標(biāo)簽上標(biāo)注量的100%或更多，而原生維生素產(chǎn)品中的維生素含量必須為標(biāo)簽上標(biāo)注量80%或更多。European Directive2002/46/EC也制定了一系列法規(guī)，用于檢測(cè)添加過(guò)維生素的食品中標(biāo)注的維生素含量[11]。2010年我國(guó)針對(duì)乳制品食品安全體系存在的一些列問(wèn)題作出了相應(yīng)的規(guī)定，出臺(tái)了最新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)作為檢測(cè)乳品中各種營(yíng)養(yǎng)素的國(guó)家強(qiáng)制性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)標(biāo)GB5413-2010[12]《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定》對(duì)嬰幼兒配方食品與奶粉中維生素含量的檢測(cè)方法、檢測(cè)限度、適用范圍等都做了明確的規(guī)定。作為乳品企業(yè)而言，產(chǎn)品必須符合國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)才可以出廠，其次了解煙酸的大致范圍可以給企業(yè)帶來(lái)新的利潤(rùn)增長(zhǎng)點(diǎn)。

牛奶屬于動(dòng)物源性食品，牛奶中煙酸的含量受飼料、季節(jié)、環(huán)境、種群和牛個(gè)體差異的影響較大，所以數(shù)據(jù)會(huì)在一定的范圍內(nèi)浮動(dòng)。

1 材料與方法

1.1 高效液相色譜法

1.1.1 材料

中國(guó)各地的牛奶樣本。

1.1.2 試劑及設(shè)備

淀粉酶：酶活力≥25 nkat/mg；鹽酸；氫氧化鈉；鹽酸（2.4 mol/L）：準(zhǔn)確移取10 mL鹽酸于50 mL容量瓶中，用水定容；氫氧化鈉溶液（2.5 mol/L）：稱(chēng)取5.0 g氫氧化鈉于50 mL容量瓶中，用水定容；高氯酸（HClO4）：體積分?jǐn)?shù)為60%；甲醇（CH4O）：色譜純；異丙醇（C3H8O）：色譜純；庚烷磺酸鈉（C7H15NaO3S）：優(yōu)級(jí)純。

U3000高效液相色譜儀（帶紫外檢測(cè)器）：美國(guó)UltiMate；pH計(jì)（精度為0.01，型號(hào)為S40+電導(dǎo)率模塊）、天平（感量為 0.1 mg，型號(hào)為 XS204）：瑞士mettler；E100H超聲波振蕩器：Elmasonic；培養(yǎng)箱（30℃～80℃，型號(hào)為Frioce11222）：德國(guó)MMM。

1.1.3 方法

試樣經(jīng)熱水提取、酸性沉淀蛋白質(zhì)后，以C18色譜柱分離，用紫外檢測(cè)器定量。

1.1.4 前處理

稱(chēng)取混合均勻固體試樣約5.0 g（精確到0.0001 g）加入約25 mL 45℃～50℃的水，或稱(chēng)取混合均勻液體試樣約20.0 g（精確到0.0001 g）于150 mL錐形瓶中，振搖，靜置5 min～10 min，充分溶解，并冷卻至室溫。將上述錐形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩約10 min。

1.1.5 測(cè)定液的制備

待試樣溶液降至室溫后，用鹽酸調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至1.7±0.1，放置約2 min后，再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至4.5±0.1。將試樣溶液轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，用水反復(fù)沖洗錐形瓶，洗液合并于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后經(jīng)濾紙過(guò)濾，濾液再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜加壓過(guò)濾，用試管收集，即為試樣待測(cè)液。

1.1.6 參考色譜條件

色譜柱：C18柱（粒徑 5 μm，150 mm×4.6 mm）或具有同等性能的色譜柱。

流動(dòng)相：甲醇70mL，異丙醇20mL，庚烷磺酸鈉1g，用910mL水溶解并混勻后，用高氯酸調(diào)pH至2.1±0.1，經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾。

流速：1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：261 nm。柱溫：25℃。進(jìn)樣量：10 μL。

1.1.7 標(biāo)準(zhǔn)品配制

煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）：稱(chēng)取煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 g（精確到0.0001 g），分別置于100 mL容量瓶中，用水溶解定容。

煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（40μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2 mL至50 mL定量瓶中，用水定容，臨用前配制。煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)系列測(cè)定液：分別準(zhǔn)確吸取煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 0.0、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，至 50 mL 容量瓶中用水定容。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0.00、0.80、1.60、4.00、8.00μg/mL。臨用前配制。

1.1.8 試樣溶液的測(cè)定

將試樣待測(cè)液進(jìn)行色譜測(cè)定。記錄各組分色譜峰面積或峰高，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣待測(cè)液中煙酸及煙酰胺各組分的濃度。

1.2 微生物法

1.2.1 材料

中國(guó)各地的牛奶樣本。

1.2.2 試劑及設(shè)備

煙酸檢測(cè)試劑盒：德國(guó)ifp公司；Elx808酶標(biāo)儀（630 nm）：美國(guó)Biotek；AIR TECH超凈臺(tái)：蘇州安泰公司；微量可調(diào)移液器（100μL～1000μL、20μL～200μL）：德國(guó) Eppendorf；一次性無(wú)菌濾膜（0.2 μm～0.22 μm）；5 mL一次性無(wú)菌注射器；15 mL無(wú)菌離心管；1.5 mL～2.0 mL無(wú)菌離心管。

1.2.3 菌種

植物乳酸桿菌 Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）。

1.2.4 方法

某些菌體生長(zhǎng)對(duì)某種特定維生素具有較強(qiáng)的依賴(lài)性。配制選擇性的培養(yǎng)基，即含有菌體生長(zhǎng)除待測(cè)維生素以外的所有營(yíng)養(yǎng)元素，待測(cè)維生素添加的多少直接影響菌體的生長(zhǎng)情況。通過(guò)添加不同濃度的待檢測(cè)維生素作為標(biāo)注曲線，就可以半定量判定樣品中的特定維生素的含量，最后通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)的濁度顯示出來(lái)，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過(guò)測(cè)定的濁度來(lái)得出樣品中的煙酸含量[13]。

1.2.5 前處理

取1 mL樣品至50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入雙蒸水39 mL，漩渦混勻。在超凈臺(tái)中用 0.2 μm～0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾至1.5 mL～2.0 mL無(wú)菌心管中。

1.2.6 培養(yǎng)基制備

加入10 mL無(wú)菌水至維生素培養(yǎng)基中，蓋好瓶蓋，搖勻。在90℃～100℃水浴中加熱5 min以上，其間振蕩至少2次，迅速冷卻至室溫（低于30℃）。使用0.2 μm～0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基至15 mL無(wú)菌離心管中。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)品配制

煙酸標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌水配置成不同的濃度梯度（0、0.016、0.032、0.064、0.096、0.160 mg/100 g），在 630 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 檢測(cè)步驟

將菌體包被于微孔中，取出需要數(shù)量的微孔板條并在板上固定，未使用的微孔板條立即放回原來(lái)的箔袋中，并與干燥劑一起重新封好，儲(chǔ)存在2℃～8℃條件下；用移液器吸取150 μL待檢維生素培養(yǎng)基至微孔中；用移液器吸取150 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品至指定的微孔中；用粘合箔蓋住微孔條或微孔；在（37±1）℃黑暗條件下孵育44 h～48 h。

1.2.9 測(cè)量及計(jì)算

將微孔板漩渦混勻，用酶標(biāo)儀630 nm條件下讀取濁度。使用維生素專(zhuān)用軟件進(jìn)行計(jì)算（4P法）。

2 結(jié)果

2.1 煙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和色譜圖

微生物法煙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1；高效液相色譜法，見(jiàn)圖2。

圖1微生物法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均為1.000，效果較好。圖2高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)品峰值和峰形較好。

2.2 不同方法檢測(cè)煙酸數(shù)據(jù)對(duì)比情況

選取10組樣本進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，微生物法和高效液相色譜法檢測(cè)牛奶中煙酸的STD、RSD和CV值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1結(jié)果顯示：微生物法和高效液相色譜法檢測(cè)牛奶中煙酸數(shù)值的CV值都在10%的范圍內(nèi)，相當(dāng)于國(guó)標(biāo)要求的檢測(cè)2個(gè)平行樣品之間的數(shù)值要求范圍，可見(jiàn)2種方法的結(jié)果是一致的，因此我們可以采用一種方法（微生物法）進(jìn)行大量樣本的檢測(cè)。

圖1 微生物法煙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Microbiological assay of nicotinic acid standard curve

圖2 高效液相色譜法Fig.2 HPLC method

表1 不同方法檢測(cè)煙酸的統(tǒng)計(jì)數(shù)值Table 1 Different methods for the detection of niacin statistics

2.3 煙酸回收率的測(cè)定

選取的20組樣本作回收率抽樣統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，微生物法回收率在79.5%～112.5%之間，檢測(cè)的結(jié)果符合回收率的要求。

2.4 煙酸相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定

選取的20組樣本，同一樣品做平行樣檢測(cè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差抽樣統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 煙酸回收率的測(cè)定結(jié)果Table 2 Nicotinic acid recovery measurement results

表3 煙酸相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定結(jié)果Table 3 Nicotinic acid and relative standard deviations of deter mination results

由表3可見(jiàn)：微生物法檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.4%～9.9%之間，檢測(cè)的結(jié)果較好。

2.5 煙酸大量數(shù)據(jù)的測(cè)定

煙酸大量數(shù)據(jù)的測(cè)定，見(jiàn)表4；煙酸的測(cè)定范圍和煙酸含量正態(tài)分布圖，見(jiàn)圖3和圖4。

表4 煙酸大量數(shù)據(jù)的測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of determination of niacin to large amounts of data

圖3 煙酸的測(cè)定范圍Fig.3 Determination of niacin range

圖4 煙酸含量正態(tài)分布圖Fig.4 Nicotinic acid content of normal distribution

由表4、圖3和圖4可見(jiàn)：410組煙酸數(shù)據(jù)平均值為 87μg/100 mL，數(shù)據(jù)范圍在 36μg/100 mL～138μg/100mL。牛奶中煙酸含量大部分在70μg/100mL～120μg/100 mL之間。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：微生物法和高效液相色譜法的檢測(cè)結(jié)果一致。另對(duì)微生物法檢測(cè)煙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)結(jié)果都很好，另外高效液相色譜法因其檢測(cè)速度較慢、成本較高，所以我們采用微生物法進(jìn)行大量樣本的測(cè)定。

微生物法對(duì)410組牛奶樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：煙酸平均值為87μg/100 mL，數(shù)據(jù)范圍在36μg/100 mL～138μg/100 mL之間。牛奶中煙酸含量大部分在 70μg/100 mL～120μg/100 mL 之間。

煙酸性質(zhì)比較穩(wěn)定，在沒(méi)有菌體污染的情況下?lián)p失較少。作為乳制品企業(yè)可以根據(jù)牛奶中煙酸的本底含量，適量添加煙酸即可以達(dá)到要求。

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