鹽酸川芎嗪注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法建立的方法學(xué)研究

張軍華，田洪根

（濱州市藥品檢驗(yàn)所，山東 濱州256618）

鹽酸川芎嗪注射液有抗血小板聚集，擴(kuò)張小動(dòng)脈，改善微循環(huán)活血化淤作用，并對(duì)已聚集的血小板有解聚作用，用于閉塞性腦血管疾病如腦供血不全、腦血栓形成、腦栓塞及其他缺血性血管疾病如冠心病、脈管炎等，臨床上常用于靜脈滴注，因此控制其細(xì)菌內(nèi)毒素含量對(duì)于藥品的安全性非常關(guān)鍵.為了更好地控制藥品質(zhì)量，筆者參照《中國(guó)藥典》2010年版（二部）中“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，通過(guò)研究，我們建立了本品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法.

1 儀器與試劑

ZH－2 BLENDER混勻器；TAL－40型恒溫器（天津藥典儀器廠）；無(wú)熱原吸頭，微量移液器.

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：150601－200965，效價(jià)180EU／支，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；鱟試劑（TAL，靈敏度0.25EU·mL－1，批號(hào)1105260，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（TAL，靈敏度0.25EU·mL－1，批號(hào)10041312，福州新北生化工業(yè)有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)10031005，福州新北生化工業(yè)有限公司 規(guī)格：5mL／支）；鹽酸川芎嗪注射液（山東濰坊制藥廠有限公司；批號(hào)：110402、110602、110603；規(guī)格：2mL：40mg）

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）復(fù)核 按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法［1］，用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ4個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明，靈敏度為0.25EU·mL－1的兩批鱟試劑符合規(guī)定，見(jiàn)表1.結(jié)果顯示：鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）在0.5～2λ之間（包括0.5λ和2λ），可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以表示靈敏度0.25EU·mL－1作為鱟試劑的靈敏度.

2.2 鹽酸川芎嗪注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定［2］藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：L＝K／M，式中K為按照規(guī)定的給藥途徑，人用每千克體重每1h可接受的內(nèi)毒素最大劑量，注射劑的K＝5EU／（kg·h）；M為人用每千克體重每1h給藥的最大供試品劑量，本品說(shuō)明書(shū)“用法用量”中規(guī)定：本品的最大給藥量為80mg，按照我國(guó)人均體重60kg計(jì)算，M＝1.333mg／（kg·h），因此細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值為：L＝K／M＝5／1.333＝3.75EU·mg－1.為了更好的保證安全用藥，我們?cè)O(shè)定本品的內(nèi)毒素限值為3.0EU·mg－1.

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

2.3 供試品的最小有效稀釋濃度（MVC） 目前市售的鱟試劑靈敏度（λ）通常在0.5～0.03EU·mL－1之間，因此，有效稀釋濃度為0.01～0.166 7mg·mL－1之間.

2.4 供試品干擾初篩試驗(yàn) 用BET水將鹽酸川芎嗪注射液（批號(hào)110602）分別稀釋成原液、10mg·mL－1、5mg·mL－1、2.5mg·mL－1、1.25mg·mL－1、0.625mg·mL－1、0.312 5mg·mL－1、0.156mg·mL－1、0.078mg·mL－1系列濃度，每一稀釋濃度供試品做2支供試品管和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照（即用該濃度的供試品稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2.0λ濃度的內(nèi)毒素溶液），與鱟試劑混合進(jìn)行抑制／增強(qiáng)試驗(yàn)，結(jié)果表明，供試品在較高濃度時(shí)對(duì)鱟試劑有干擾作用.在供試品至少稀釋至濃度為0.156mg·mL－1后則對(duì)鱟試劑無(wú)干擾作用，見(jiàn)表2.

表2 干擾試驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 供試品干擾試驗(yàn) 由干擾初篩試驗(yàn)可知，選擇靈敏度0.25EU·mL－1的TAL，用BET水將3批供試品稀釋至濃度為0.156mg·mL－1后進(jìn)行干擾試驗(yàn).具體操作步驟如下：取36支靈敏度0.25EU·mL－1的TAL，其中18支做內(nèi)毒素水溶液系列反應(yīng)，即用0.1mL BET水復(fù)溶，再分別加已制備的0.5，0.25，0.125，0.06EU·mL－1內(nèi)毒素溶液0.1 mL，每一濃度內(nèi)毒素4支反應(yīng)管，水溶液陰性對(duì)照（NC）2支反應(yīng)管；另18支做內(nèi)毒素供試品溶液系列反應(yīng)，即用0.1 mL BET水復(fù)溶，再分別加已制備的含0.5，0.25，0.125，0.06EU·mL－1內(nèi)毒素的濃度為0.156mg·mL－1的供試品溶液0.1mL，每一濃度內(nèi)毒素4支反應(yīng)管，供試品陰性對(duì)照（NPC）2支反應(yīng)管.采用3批供試品，兩批不同廠家的鱟試劑，分別進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，Et均在0.5～2.0Es范圍內(nèi)，說(shuō)明供試品稀釋至濃度為0.156mg·mL－1后確已排除干擾作用，在低于或等于此濃度的情況下即可使用內(nèi)毒素檢查法.

表3 干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.6 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 采用鱟試劑（TAL，靈敏度0.25EU·mL－1，批號(hào)1105260，湛江安度斯生物有限公司），按照《中國(guó)藥典》附錄 XI E對(duì)供試品 （批號(hào)：110402、110602、110603）進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，結(jié)果3批供試品每1mg鹽酸川芎嗪中含內(nèi)毒素的量均小于3.0EU.

3 討論

3.1 通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，本法可用于鹽酸川芎嗪注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，檢查時(shí)只要將其至少稀釋至濃度為0.156mg mL－1，在低于或等于此濃度的情況下，選擇相應(yīng)靈敏度的鱟試劑即可進(jìn)行本品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查.

3.2 不同鱟試劑對(duì)供試品的反應(yīng)有差異.本實(shí)驗(yàn)采用兩種不同批號(hào)的鱟試劑同時(shí)進(jìn)行干擾試驗(yàn)，得到了較為滿意結(jié)果.

［1］中國(guó)生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：310.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版（二部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄99.