轉(zhuǎn)化生長因子-β1 對大鼠牙周組織中白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響

張小恒，余占海，張國英

（1.甘谷縣人民醫(yī)院，甘肅 甘谷 741200；2.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

實(shí)驗(yàn)表明，TGF-β1 在體外具有促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖和分化的作用，而牙周膜細(xì)胞又是牙周組織再生的基礎(chǔ)[1]，TGF-β1能抑制大鼠牙周炎模型牙周組織中IL-6 的表達(dá)，對骨鈣素的表達(dá)起促進(jìn)作用，同時(shí)還能促進(jìn)牙周組織再生[2]。本實(shí)驗(yàn)在成功建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的基礎(chǔ)上，通過注射TGF-β1，觀察大鼠牙周組織病理變化狀況，并采用免疫組織化學(xué)SABC 法檢測大鼠牙周組織中IL-1β、TNF-α水平變化，從而探討TGF-β1治療牙周炎的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

TGF-β1(PeproTech 公司)，二甲基亞砜（亞太精細(xì)化工公司），鹽酸氯胺酮注射液（古田藥業(yè)有限公司），濃度為0.01 mol/L 的PBS、0.01 mol/L 的枸櫞酸鹽緩沖液和DAB 顯色試劑盒（中杉金橋有限公司），即用SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒（武漢博士德生物有限公司），多聚賴氨酸（中杉金橋有限公司），兔抗IL-1β單克隆抗體、兔抗TNF-α 單克隆抗體（武漢博士德生物有限公司），AX80 自動研究級系統(tǒng)顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 Wistar 大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立

選用160～200 g Wistar 大鼠50只，雌雄各半，以10 ml/kg腹腔注射鹽酸氯胺酮全麻成功后，固定四肢及頭部，牽開口角，用口腔正畸結(jié)扎鋼絲（直徑0.2 mm）結(jié)扎右上頜第2 磨牙一圈，將結(jié)扎絲放入游離齦內(nèi)，深度以不損傷牙齦的結(jié)合上皮，又要盡可能避免結(jié)扎后發(fā)生滑脫現(xiàn)象。同時(shí)，肌注醋酸潑尼松龍5 mg/kg，每2日一次，共7次；然后每3日一次，共2次，定期復(fù)查。采取頸椎脫臼法處死隨機(jī)抽取的5只造模大鼠和5只未造模大鼠（其中未造模大鼠為正常對照組），5 min 內(nèi)剪取右上頜、牙槽骨、牙及牙周組織，去除結(jié)扎鋼絲，拍X 線牙片，生理鹽水沖洗后置于體積為4%多聚甲醛和濃度為0.01 mol/L 的PBS緩沖液（pH=7.2）中，于4℃冰箱中固定24 h 后取出標(biāo)本，蒸餾水沖洗0.5 h，投入體積分?jǐn)?shù)為10%的EDTA（pH=7.4）中脫鈣，微波加熱脫鈣（溫度低于15℃，時(shí)間9～10 h），制作右上頜第2磨牙頰腭向石蠟切片，片厚5μm，蘇木精-伊紅染色，觀察牙槽骨吸收及牙周袋形成情況。

1.3 鹽酸小檗堿對實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎的治療作用

將造模成功的40只Wistar 大鼠隨機(jī)分為兩組，即牙周炎組和牙周炎治療組，牙周炎治療組每日每只大鼠于左上頜第2磨牙頰腭側(cè)骨膜下各注射0.1 mg/L 的TGF-β10.05 ml；牙周炎組注射等劑量的生理鹽水。兩組動物分別于用藥1、2、3、4周后處死（每次10只），采取前述方法制作牙周組織切片，行常規(guī)HE 染色，觀察牙周組織病理變化狀況，并采取免疫組織化學(xué)SABC 法檢測兩組牙周組織中IL-1β、TNF-α水平的變化。

1.4 圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用平均光密度值分析，免疫組化染色信號越強(qiáng)，平均光密度值越高，表明兩者呈正向關(guān)系。結(jié)果用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

牙周炎組大鼠在注射醋酸潑尼松龍第四天后出現(xiàn)拱背卷曲、皮毛疏松、無光澤、少動倦怠、進(jìn)食下降、大便干燥等癥狀，隨著注射次數(shù)的增加，上述癥狀日益加重；牙周炎治療組大鼠隨著服藥時(shí)間的增加，上述癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，治療4周后，牙周炎治療組較牙周炎組大鼠全身狀態(tài)明顯改善，皮毛逐漸恢復(fù)光澤，食欲改善，活動增加，正常對照組大鼠表現(xiàn)正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，牙周炎治療組大鼠全身狀況基本恢復(fù)到正常大鼠水平。

2.2 口腔肉眼觀察及X 線檢查

牙周炎組大鼠在實(shí)驗(yàn)后第四天，左上頜第2 磨牙牙齦組織出現(xiàn)紅腫，1周后牙齦腫脹暗紅，觸及易出血，以后牙周袋形成、加深，齦組織糜爛溢膿；牙周炎治療組上述癥狀緩解；正常組牙周組織無異常。X 線檢查正常對照組表現(xiàn)正常，而牙周炎組左上頜第2 磨牙近遠(yuǎn)中牙槽骨嵴吸收，根間陰影明顯，嚴(yán)重的吸收已達(dá)根中1/2。

2.3 牙周組織病理變化

正常對照組牙齦上皮和上皮下結(jié)締組織無病理性改變，牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨表面光滑，無明顯骨吸收，無破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩形成（見圖1）。牙周炎組牙間乳頭溝內(nèi)上皮潰瘍、壞死、牙周袋形成，牙周膜炎癥明顯，牙周膜纖維排列紊亂，牙槽嵴吸收明顯，表面呈蠶食狀，牙槽骨呈骨質(zhì)疏松狀態(tài)，可見明顯的破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩（見圖2）。牙周炎治療組牙周組織表現(xiàn)較牙周炎組好，表現(xiàn)為磨牙間牙周袋逐漸變淺，炎性細(xì)胞逐漸減少，成纖維性細(xì)胞逐漸增多，牙周間隙逐漸恢復(fù)正常，牙周膜及牙槽骨結(jié)構(gòu)接近正常，牙周膜主纖維束排列整齊，固有層僅見少量血管擴(kuò)張、淋巴細(xì)胞滲出，顯示牙周組織處于炎癥修復(fù)期（見圖3）。

圖1 正常對照組（HE ×20）

圖2 牙周炎組（HE ×20）

圖3 牙周炎治療組（HE ×20）

2.4 各組大鼠牙周組織中IL-1β、TNF-α的含量分析

大鼠牙周組織中IL-1β、TNF-α陽性著色部位位于細(xì)胞漿，呈棕黃色，圖像分析時(shí)采用平均光密度值，免疫組化染色信號越強(qiáng)，平均光密度值越高，表明兩者呈正向關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牙周炎組牙周組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯高于正常對照組（P＜0.05）；各時(shí)間段牙周炎治療組牙周組織中 IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯低于牙周炎組（P＜0.05），各時(shí)間段牙周炎治療組牙周組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)無明顯差異，見表1。

表1 各組大鼠牙周組織中IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況

3 討論

TGF-β1 為TGF-β的亞型之一，是一類多功能肽，在體內(nèi)分布廣泛，涉及胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、組織修復(fù)以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等過程，并可促進(jìn)纖維結(jié)締組織細(xì)胞的移行、增殖、生長、分化及促進(jìn)創(chuàng)傷的早期愈合。

IL-1 是一種單核因子，多種細(xì)胞均會產(chǎn)生，包括IL-1α、IL-1β及其受體拮抗劑等，可作用于機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)，具有廣泛的生物學(xué)活性，參與免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和影響組織代謝，能刺激骨髓多能干細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其他多種細(xì)胞因子，如IL-2、IL-6、TNF 等分泌。腫瘤壞死因子分為兩種，即TNF-α和TNF-β。其細(xì)胞來源范圍較廣，包括單核巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。其主要生物學(xué)活性有：（1）增強(qiáng)或促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞（起先是中性粒細(xì)胞，隨后是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）之間的黏附，有助于白細(xì)胞聚集于炎癥局部；（2）激活炎性浸潤的白細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等，從而殺死病原微生物；（3）刺激單核巨噬細(xì)胞和其他類型細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、IL-2 及TNF 等炎性細(xì)胞因子，以放大或間接增強(qiáng)其本身效應(yīng)。IL-1β和TNF-α的主要功能是致炎作用，并能直接或間接地介導(dǎo)骨組織吸收，其多種生物學(xué)效應(yīng)與牙周組織的破壞直接相關(guān)，被認(rèn)為是介導(dǎo)牙周炎癥過程的重要因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者齦溝液中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平高于牙齦炎患者，牙周炎和牙齦炎患者齦溝液中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯高于健康者；慢性牙周炎患者齦溝液中IL-β、TNF-α水平與牙槽骨吸收活性呈正相關(guān)，通過牙周治療，齦溝液中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯降低。有研究認(rèn)為IL-1、TNF-α表達(dá)水平在一定程度上反映了慢性牙周炎和成人牙周炎病情的嚴(yán)重程度，提示IL-1β、TNF-α與牙周炎的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[4～6]。

在本研究中，經(jīng)TGF-β1 治療后的牙周炎大鼠模型，從一般情況到組織形態(tài)學(xué)觀察，牙周炎治療組與牙周炎組相比均有明顯好轉(zhuǎn)，其牙周組織中IL-1β和TNF-α水平也較牙周炎組顯著降低（P＜0.05）。這一方面說明，牙周組織中IL-1β 和TNF-α的含量與牙周炎的嚴(yán)重程度和骨質(zhì)破壞程度有相關(guān)性；另一方面說明，TGF-β1可以降低炎性反應(yīng)時(shí)的牙周組織中IL-1β和TNF-α水平，避免機(jī)體炎性反應(yīng)過激，直接和間接地抑制骨吸收，其作用主要為抑制炎性細(xì)胞向牙周組織的聚集，減少單核細(xì)胞向骨的聚集，減少破骨細(xì)胞的形成，減輕破骨作用。上述結(jié)果顯示，牙周炎組大鼠模型牙周組織中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平較正常對照組明顯升高，應(yīng)用TGF-β1 能抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠模型牙周組織中TNF-α、IL-1β的表達(dá)。

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