張小恒,余占海,張國英
(1.甘谷縣人民醫(yī)院,甘肅 甘谷 741200;2.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000)
實(shí)驗(yàn)表明,TGF-β1 在體外具有促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖和分化的作用,而牙周膜細(xì)胞又是牙周組織再生的基礎(chǔ)[1],TGF-β1能抑制大鼠牙周炎模型牙周組織中IL-6 的表達(dá),對骨鈣素的表達(dá)起促進(jìn)作用,同時(shí)還能促進(jìn)牙周組織再生[2]。本實(shí)驗(yàn)在成功建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的基礎(chǔ)上,通過注射TGF-β1,觀察大鼠牙周組織病理變化狀況,并采用免疫組織化學(xué)SABC 法檢測大鼠牙周組織中IL-1β、TNF-α水平變化,從而探討TGF-β1治療牙周炎的分子機(jī)制。
TGF-β1(PeproTech 公司),二甲基亞砜(亞太精細(xì)化工公司),鹽酸氯胺酮注射液(古田藥業(yè)有限公司),濃度為0.01 mol/L 的PBS、0.01 mol/L 的枸櫞酸鹽緩沖液和DAB 顯色試劑盒(中杉金橋有限公司),即用SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒(武漢博士德生物有限公司),多聚賴氨酸(中杉金橋有限公司),兔抗IL-1β單克隆抗體、兔抗TNF-α 單克隆抗體(武漢博士德生物有限公司),AX80 自動研究級系統(tǒng)顯微鏡(Olympus公司)。
選用160~200 g Wistar 大鼠50只,雌雄各半,以10 ml/kg腹腔注射鹽酸氯胺酮全麻成功后,固定四肢及頭部,牽開口角,用口腔正畸結(jié)扎鋼絲(直徑0.2 mm)結(jié)扎右上頜第2 磨牙一圈,將結(jié)扎絲放入游離齦內(nèi),深度以不損傷牙齦的結(jié)合上皮,又要盡可能避免結(jié)扎后發(fā)生滑脫現(xiàn)象。同時(shí),肌注醋酸潑尼松龍5 mg/kg,每2日一次,共7次;然后每3日一次,共2次,定期復(fù)查。采取頸椎脫臼法處死隨機(jī)抽取的5只造模大鼠和5只未造模大鼠(其中未造模大鼠為正常對照組),5 min 內(nèi)剪取右上頜、牙槽骨、牙及牙周組織,去除結(jié)扎鋼絲,拍X 線牙片,生理鹽水沖洗后置于體積為4%多聚甲醛和濃度為0.01 mol/L 的PBS緩沖液(pH=7.2)中,于4℃冰箱中固定24 h 后取出標(biāo)本,蒸餾水沖洗0.5 h,投入體積分?jǐn)?shù)為10%的EDTA(pH=7.4)中脫鈣,微波加熱脫鈣(溫度低于15℃,時(shí)間9~10 h),制作右上頜第2磨牙頰腭向石蠟切片,片厚5μm,蘇木精-伊紅染色,觀察牙槽骨吸收及牙周袋形成情況。
將造模成功的40只Wistar 大鼠隨機(jī)分為兩組,即牙周炎組和牙周炎治療組,牙周炎治療組每日每只大鼠于左上頜第2磨牙頰腭側(cè)骨膜下各注射0.1 mg/L 的TGF-β10.05 ml;牙周炎組注射等劑量的生理鹽水。兩組動物分別于用藥1、2、3、4周后處死(每次10只),采取前述方法制作牙周組織切片,行常規(guī)HE 染色,觀察牙周組織病理變化狀況,并采取免疫組織化學(xué)SABC 法檢測兩組牙周組織中IL-1β、TNF-α水平的變化。
采用平均光密度值分析,免疫組化染色信號越強(qiáng),平均光密度值越高,表明兩者呈正向關(guān)系。結(jié)果用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
牙周炎組大鼠在注射醋酸潑尼松龍第四天后出現(xiàn)拱背卷曲、皮毛疏松、無光澤、少動倦怠、進(jìn)食下降、大便干燥等癥狀,隨著注射次數(shù)的增加,上述癥狀日益加重;牙周炎治療組大鼠隨著服藥時(shí)間的增加,上述癥狀逐漸好轉(zhuǎn),治療4周后,牙周炎治療組較牙周炎組大鼠全身狀態(tài)明顯改善,皮毛逐漸恢復(fù)光澤,食欲改善,活動增加,正常對照組大鼠表現(xiàn)正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),牙周炎治療組大鼠全身狀況基本恢復(fù)到正常大鼠水平。
牙周炎組大鼠在實(shí)驗(yàn)后第四天,左上頜第2 磨牙牙齦組織出現(xiàn)紅腫,1周后牙齦腫脹暗紅,觸及易出血,以后牙周袋形成、加深,齦組織糜爛溢膿;牙周炎治療組上述癥狀緩解;正常組牙周組織無異常。X 線檢查正常對照組表現(xiàn)正常,而牙周炎組左上頜第2 磨牙近遠(yuǎn)中牙槽骨嵴吸收,根間陰影明顯,嚴(yán)重的吸收已達(dá)根中1/2。
正常對照組牙齦上皮和上皮下結(jié)締組織無病理性改變,牙周膜纖維排列整齊,牙槽骨表面光滑,無明顯骨吸收,無破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩形成(見圖1)。牙周炎組牙間乳頭溝內(nèi)上皮潰瘍、壞死、牙周袋形成,牙周膜炎癥明顯,牙周膜纖維排列紊亂,牙槽嵴吸收明顯,表面呈蠶食狀,牙槽骨呈骨質(zhì)疏松狀態(tài),可見明顯的破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩(見圖2)。牙周炎治療組牙周組織表現(xiàn)較牙周炎組好,表現(xiàn)為磨牙間牙周袋逐漸變淺,炎性細(xì)胞逐漸減少,成纖維性細(xì)胞逐漸增多,牙周間隙逐漸恢復(fù)正常,牙周膜及牙槽骨結(jié)構(gòu)接近正常,牙周膜主纖維束排列整齊,固有層僅見少量血管擴(kuò)張、淋巴細(xì)胞滲出,顯示牙周組織處于炎癥修復(fù)期(見圖3)。
圖1 正常對照組(HE ×20)
圖2 牙周炎組(HE ×20)
圖3 牙周炎治療組(HE ×20)
大鼠牙周組織中IL-1β、TNF-α陽性著色部位位于細(xì)胞漿,呈棕黃色,圖像分析時(shí)采用平均光密度值,免疫組化染色信號越強(qiáng),平均光密度值越高,表明兩者呈正向關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),牙周炎組牙周組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯高于正常對照組(P<0.05);各時(shí)間段牙周炎治療組牙周組織中 IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯低于牙周炎組(P<0.05),各時(shí)間段牙周炎治療組牙周組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)無明顯差異,見表1。
表1 各組大鼠牙周組織中IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況
TGF-β1 為TGF-β的亞型之一,是一類多功能肽,在體內(nèi)分布廣泛,涉及胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、組織修復(fù)以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等過程,并可促進(jìn)纖維結(jié)締組織細(xì)胞的移行、增殖、生長、分化及促進(jìn)創(chuàng)傷的早期愈合。
IL-1 是一種單核因子,多種細(xì)胞均會產(chǎn)生,包括IL-1α、IL-1β及其受體拮抗劑等,可作用于機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng),具有廣泛的生物學(xué)活性,參與免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和影響組織代謝,能刺激骨髓多能干細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其他多種細(xì)胞因子,如IL-2、IL-6、TNF 等分泌。腫瘤壞死因子分為兩種,即TNF-α和TNF-β。其細(xì)胞來源范圍較廣,包括單核巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。其主要生物學(xué)活性有:(1)增強(qiáng)或促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞(起先是中性粒細(xì)胞,隨后是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)之間的黏附,有助于白細(xì)胞聚集于炎癥局部;(2)激活炎性浸潤的白細(xì)胞,如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等,從而殺死病原微生物;(3)刺激單核巨噬細(xì)胞和其他類型細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、IL-2 及TNF 等炎性細(xì)胞因子,以放大或間接增強(qiáng)其本身效應(yīng)。IL-1β和TNF-α的主要功能是致炎作用,并能直接或間接地介導(dǎo)骨組織吸收,其多種生物學(xué)效應(yīng)與牙周組織的破壞直接相關(guān),被認(rèn)為是介導(dǎo)牙周炎癥過程的重要因子[3]。研究發(fā)現(xiàn),牙周炎患者齦溝液中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平高于牙齦炎患者,牙周炎和牙齦炎患者齦溝液中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯高于健康者;慢性牙周炎患者齦溝液中IL-β、TNF-α水平與牙槽骨吸收活性呈正相關(guān),通過牙周治療,齦溝液中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯降低。有研究認(rèn)為IL-1、TNF-α表達(dá)水平在一定程度上反映了慢性牙周炎和成人牙周炎病情的嚴(yán)重程度,提示IL-1β、TNF-α與牙周炎的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[4~6]。
在本研究中,經(jīng)TGF-β1 治療后的牙周炎大鼠模型,從一般情況到組織形態(tài)學(xué)觀察,牙周炎治療組與牙周炎組相比均有明顯好轉(zhuǎn),其牙周組織中IL-1β和TNF-α水平也較牙周炎組顯著降低(P<0.05)。這一方面說明,牙周組織中IL-1β 和TNF-α的含量與牙周炎的嚴(yán)重程度和骨質(zhì)破壞程度有相關(guān)性;另一方面說明,TGF-β1可以降低炎性反應(yīng)時(shí)的牙周組織中IL-1β和TNF-α水平,避免機(jī)體炎性反應(yīng)過激,直接和間接地抑制骨吸收,其作用主要為抑制炎性細(xì)胞向牙周組織的聚集,減少單核細(xì)胞向骨的聚集,減少破骨細(xì)胞的形成,減輕破骨作用。上述結(jié)果顯示,牙周炎組大鼠模型牙周組織中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平較正常對照組明顯升高,應(yīng)用TGF-β1 能抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠模型牙周組織中TNF-α、IL-1β的表達(dá)。
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