UC-MSC移植對(duì)CIA大鼠炎癥因子表達(dá)水平的調(diào)控作用

李 慧 顧 健 林傳明 顧 薇 沈連軍

1.江蘇省蘇北人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇揚(yáng)州 225001；2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院血液科 揚(yáng)州市血液學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225001

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以累及周圍性小關(guān)節(jié)為主的系統(tǒng)性、炎癥性自身免疫疾病，以關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及血管翳形成為主要病理特征[1]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 （umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）是來源于臍帶華通氏膠的一類多能干細(xì)胞，具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能，以抑制炎性反應(yīng)為主要特征。本文以膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠為研究對(duì)象，觀察UC-MSC對(duì)CIA大鼠炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，為臨床應(yīng)用UC-MSC治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 周齡，雌性，清潔級(jí) SD 大鼠，90 只，平均體重（175±10）g，購置于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CIA大鼠模型建立 ①分組:90只SD大鼠隨機(jī)分為三組:空白對(duì)照組、模型組、UC-MSC治療組，每組各30只；②造模:揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，模型組及UC-MSC治療組在乙醚麻醉下于第1天以每只0.1 mL（含雞Ⅱ型膠原0.25 mg及0.05 mL完全弗氏佐劑）于SD大鼠右后足跖皮內(nèi)注射，至第21天同前劑量于大鼠尾根部、左后足跖皮內(nèi)再次多點(diǎn)激發(fā)免疫?？瞻讓?duì)照組以生理鹽水注射，方法同造模組。

1.2.2 UC-MSC移植 取融合度 85%的 P3代 UC-MSC，用0.25%胰蛋白酶消化，生理鹽水清洗3遍，制成濃度為2×106/mL細(xì)胞懸液，用1 mL無菌注射器抽吸分裝成0.5 mL/支（含1×106個(gè)細(xì)胞）。于造模完成后1周經(jīng)大鼠尾靜脈注射制備好的UC-MSC懸液0.5 mL/只；空白對(duì)照組及模型組同法注射等量生理鹽水。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 從免疫當(dāng)日起，采用雙人雙盲的方式在初免后1、2、3周，及治療后1～5周，每周觀察并采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分法評(píng)定大鼠關(guān)節(jié)癥狀的嚴(yán)重程度。

1.3.2 于UC-MSC移植治療后第1、3、5周，分別取空白對(duì)照組及模型組、UC-MSC組大鼠，麻醉大鼠后，經(jīng)腹腔靜脈取血4 mL置分離膠干燥管中，以3000 r/min、離心10 min后提取血清，置-20℃冰箱保存待測(cè)。用ELISA法檢測(cè)血清白介素-1（IL-1）、IL-10、IL-17、IL-18。

1.4 AI評(píng)分法標(biāo)準(zhǔn)

據(jù)關(guān)節(jié)紅腫范圍和變形情況對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)估。每只大鼠四肢評(píng)分相加，總分最高為16分。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):0分=無關(guān)節(jié)炎；1分=有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹；2分=關(guān)節(jié)部位中度腫脹；3分=嚴(yán)重腫脹，甚至皮膚破潰；4分=嚴(yán)重腫脹且不能負(fù)重。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2003軟件及統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIA大鼠一般情況及關(guān)節(jié)癥狀

所有CIA大鼠飲食及活動(dòng)減少，神疲乏力，體重增長(zhǎng)減慢；于初次免疫后第2天注射處足踝、趾、膝關(guān)節(jié)即出現(xiàn)瘀斑、輕度紅腫；第6天開始紅腫加重，關(guān)節(jié)處皮膚充血發(fā)亮，甚至破潰，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限伴負(fù)重困難、活動(dòng)障礙，紅腫逐步向?qū)?cè)后肢及雙前肢蔓延?？瞻讓?duì)照組無上述表現(xiàn)，見圖1。

圖1 造模前后大鼠關(guān)節(jié)表現(xiàn)

2.2 各組不同時(shí)期AI評(píng)分結(jié)果比較

模型組及UC-MSC治療組CIA大鼠AI評(píng)分于初次免疫后第1周開始升高，至加強(qiáng)免疫后1周達(dá)最高，此后雖有下降，但仍維持在高水平狀態(tài)，與同時(shí)期空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P<0.05）；UC-MSC治療組大鼠經(jīng)UC-MSC治療后AI評(píng)分逐漸降低，與同時(shí)期模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見表1。

2.3 各組不同時(shí)期血清 IL-1、IL-10、IL-17、IL-18 濃度比較

模型組 CIA 大鼠于治療后第 1、3、5 周 IL-1、IL-17、IL-18平均水平明顯高于同期空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），而IL-10水平明顯低于同期空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）；UC-MSC治療組治療后第1、3周時(shí)IL-1、IL-17、IL-18水平較同期模型組顯著降低、IL-10水平逐步上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），至第5周上述指標(biāo)與空白對(duì)照組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 不同組期大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)AI評(píng)分（±s，分）

表1 不同組期大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)AI評(píng)分（±s，分）

注:與同時(shí)期空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與同時(shí)期模型組比較，ΔP＜0.05

組別 只數(shù) 造模前 初次免疫1周初次免疫2周初次免疫3周加強(qiáng)免疫1周治療1周治療2周治療3周治療4周治療5周空白對(duì)照組模型組UC-MSC治療組3030300000004.56±0.12*4.47±0.31*6.79±0.54*6.11±0.44*8.23±0.33*8.13±0.42*0000009.65±0.28*9.60±0.19*8.15±0.19*7.34±0.41*Δ 7.98±0.41*6.29±0.16*Δ 7.35±0.63*5.68±0.22*Δ 7.31±0.27*4.67±0.55*Δ 7.52±0.18*3.01±0.72Δ

表2 各組不同時(shí)期血清IL-1、IL-17濃度結(jié)果比較（±s，pg/mL）

表2 各組不同時(shí)期血清IL-1、IL-17濃度結(jié)果比較（±s，pg/mL）

注:與同時(shí)期空白對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05；與同時(shí)期模型組比較，ΔP ＜ 0.05

組別 只數(shù) IL-1（pg/mL）治療1周 治療3周 治療5周IL-17（pg/mL）治療1周 治療3周 治療5周空白對(duì)照組模型組UC-MSC治療組30303033.08±8.1165.33±12.21*5.38±6.48*Δ 36.63±9.6657.70±5.09*42.16±8.24Δ 71.98±1.9866.20±0.79*74.42±2.58*Δ 73.77±1.8670.72±0.19*73.24±8.96Δ 75.60±6.5269.97±0.29*77.92±0.01Δ 34.24±4.3450.55±9.61*33.01±6.54Δ組別 只數(shù) IL-10（ng/L）治療1周 治療3周 治療5周IL-18（ng/L）治療1周 治療3周 治療5周空白對(duì)照組模型組UC-MSC治療組303030168.72±29.56277.12±20.82*222.86±24.50*Δ 212.23±32.77317.16±38.85*234.46±28.41Δ 255.52±21.71325.50±28.39*250.56±27.22Δ 221.32±3.94250.03±10.48*232.72±3.85*Δ 210.79±2.97225.76±3.91*226.13±4.95*222.39±9.71222.82±1.83217.41±1.06*Δ?

3 討論

RA是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫疾病，在其發(fā)生、發(fā)展過程中存在多種細(xì)胞因子分泌的異常。CIA大鼠是RA最常用、最經(jīng)典的動(dòng)物模型，其特征除病變關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨及骨組織破壞外，還兼有體液免疫及細(xì)胞免疫功能紊亂的特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制與人類RA有很多相似之處[2]。本文采用P3代UC-MSC治療CIA大鼠，以探討其對(duì)CIA大鼠炎性因子的免疫調(diào)節(jié)作用。

UC-MSC是來源于臍帶華通氏膠發(fā)育早期中胚層的多能干細(xì)胞，具有自我更新、高增殖分化潛能及免疫調(diào)節(jié)等功能的多能干細(xì)胞，無MHC的限制，效應(yīng)呈劑量依賴性[3]。除能抑制促炎癥細(xì)胞的增殖和促炎性細(xì)胞因子的分泌之外，還能在特定的微環(huán)境中直接分化為各種組織細(xì)胞進(jìn)行損傷修復(fù)[4]。

本研究觀察到，造模后CIA大鼠關(guān)節(jié)明顯紅腫、活動(dòng)功能受限，AI評(píng)分亦逐漸增高，其血清IL-1、IL-17、IL-18水平明顯高于正?？瞻讓?duì)照組，而IL-10水平則顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。既往研究表明，IL-1是主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的最具有多效性的細(xì)胞因子之一，可調(diào)節(jié)多種炎性細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)分子及前炎癥介質(zhì)的表達(dá)，能導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的破壞與重建，加快RA的關(guān)節(jié)破壞進(jìn)程，在RA的骨侵蝕及軟骨破壞中發(fā)揮重要作用[5]。IL-17主要由輔助性Th17細(xì)胞產(chǎn)生，可刺激成纖維細(xì)胞、上皮及內(nèi)皮細(xì)胞釋放多種促炎癥細(xì)胞因子，并可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）、促進(jìn)T細(xì)胞增殖，以及與多種細(xì)胞因子協(xié)同放大炎癥反應(yīng)，加劇RA關(guān)節(jié)的破壞[6]。IL-18是天然性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。研究亦表明RA患者的血清和滑液中的IL-18均明顯升高，并且滑液中IL-18水平與RA活動(dòng)呈相關(guān)性[7-8]，此外，IL-18可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞生成基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1等而促進(jìn)軟骨的降解[9]。IL-10是一種重要的炎癥抑制因子，主要是由活化的Th2細(xì)胞、單核細(xì)胞及B細(xì)胞產(chǎn)生，可抑制有核細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子IL-1、腫瘤壞死因子-α等以發(fā)揮抗炎作用，亦可抑制單核細(xì)胞表面分子的表達(dá)，降低單核細(xì)胞的提呈抗原能力，阻斷抗原特異性單核-巨噬細(xì)胞因子的產(chǎn)生。有研究認(rèn)為，IL-10水平的降低可能會(huì)導(dǎo)致RA炎癥的發(fā)展和組織破壞的加重[10]。本研究中，經(jīng)UC-MSC治療后IL-1、IL-17、IL-18水平逐漸降低、IL-10水平回升（P<0.05），至實(shí)驗(yàn)觀察后期所有指標(biāo)水平均接近空白對(duì)照組（P>0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CIA大鼠體內(nèi)存在免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-17、IL-18分泌異常增高，而炎癥抑制因子IL-10水平降低，機(jī)體處于促炎功能亢進(jìn)、炎癥抑制功能缺陷的狀態(tài)，從而導(dǎo)致了疾病的發(fā)生與發(fā)展。UC-MSC可顯著降低CIA大鼠血清炎癥因子IL-1、IL-17、IL-18水平，而上調(diào)IL-10水平，通過其免疫調(diào)節(jié)功能恢復(fù)機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡狀態(tài)，減少炎性物質(zhì)的滲出，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)病變關(guān)節(jié)恢復(fù)。另外，有研究表明UC-MSC可靶向歸巢至炎癥病變部位，促進(jìn)病變恢復(fù)。

總之，RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為與機(jī)體免疫功能紊亂有關(guān)，其機(jī)體免疫功能處于紊亂狀態(tài)，使促炎癥細(xì)胞激活及功能亢進(jìn)，而炎癥抑制細(xì)胞下調(diào)及功能缺陷，從而引起細(xì)胞因子的釋放及其他免疫細(xì)胞的活化、免疫球蛋白、趨化因子、氧自由基及白三烯等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生增多，進(jìn)而引起關(guān)節(jié)血管炎、滑膜增生、軟骨及骨破壞。本研究中采用的UCMSC具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，既可在多環(huán)節(jié)上調(diào)節(jié)免疫，誘導(dǎo)免疫重建，恢復(fù)機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡狀態(tài)；又可通過炎性趨化作用直接參與損傷的修復(fù)，并能分泌多種基質(zhì)分子，改善局部受損微環(huán)境加速損傷修復(fù)，促進(jìn)病變恢復(fù)，為臨床運(yùn)用UC-MSC治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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