馬錢子優(yōu)化總生物堿的制備與評價

李 俊 嚴道南

南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 210046

傳統(tǒng)大毒中藥馬錢子，又名番木鱉，是馬錢科植物馬錢（Strychnou nux-vomica L.）的干燥成熟種子，最早的記載見于《本草綱目·卷十八》，藥理學研究表明其具有消腫止痛、抗炎、抗腫瘤等藥理作用，因此，在中醫(yī)藥臨床上得到廣泛應用，可用于治療風濕痹痛、面神經(jīng)麻痹、腫瘤等疾病。

實驗研究證實馬錢子中的總生物堿為其主要有效成分，而總生物堿中又含有至少16種的生物堿成分[1]，其中馬錢子堿和士的寧為其主要成分，兩者的含量分析多以單獨進行[2-3]，研究表明兩者的總含量約占總生物堿的一半。其中，士的寧的毒性是馬錢子堿的45～71倍[4-5]，且藥效學研究表明其在消腫止痛方面幾乎沒有活性[6]，因此，本文利用的寧和馬錢子堿在50%乙醇中溶解度相差懸殊的原理除去馬錢子總生物堿中大部分士的寧，從而得到馬錢子優(yōu)化總生物堿，并進行了成分分析、安全性與藥效評價，對于具有高度安全性的馬錢子制劑的開發(fā)無疑具有重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-20A高效液相色譜儀；AS1201自動進樣器（大連依利特分析儀器有限公司）；UV2800AH紫外分光光度計（優(yōu)尼柯儀器有限公司）；BS124S電子分析天平（德國賽多利斯公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；循環(huán)水式真空泵，型號SHZ-D（Ⅲ）（鞏義市予華儀器有限責任公司）；PHS-3C PH計（上海雷磁公司）；真空干燥箱，型號DZF-6020（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試劑

本實驗中所使用的馬錢子為浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠生產(chǎn)（生產(chǎn)批號：20090219），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學蔡寶昌教授鑒定證實為馬錢科植物馬錢（Strychnos nux-vomica.L.）的干燥成熟種子；士的寧對照品（中國藥品生物制品檢定所），馬錢子堿對照品（中國藥品生物制品檢定所）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司），其余試劑均為分析純。

1.3 動物

ICR小鼠，許可證號：SCXK（蘇）2007-0001，雌雄各半，體重18～22 g，購自揚州大學比較醫(yī)學中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬錢子總生物堿的提取與純化

稱取生馬錢子粉末50 g，過50目篩，以15倍量的70%乙醇回流提取半小時，共重復操作3次，合并3次所得濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液真空干燥濃縮至干粉末狀，取1 mol/L鹽酸100 mL將粉末溶解，以4 000 r/min離心10 min，取得上清液，用40%NaOH將pH調(diào)整為12，用二氯甲烷萃取后合并二氯甲烷萃取液，真空干燥并精密稱重，得到馬錢子總生物堿，得率為（3.11±0.33）%（n=5）。

2.2 馬錢子優(yōu)化總生物堿的制備

稱取馬錢子總生物堿粉末共100 mg，用60 mL 50%乙醇將粉末溶解，置于真空干燥箱中濃縮，燒瓶內(nèi)壁上可見大量白色結(jié)晶析出，取濃縮液水浴繼續(xù)濃縮至原體積的8%后，4 000 r/min離心10 min，倒出上清液，4℃冰箱中靜置過夜，4 000 r/min離心20 min后棄沉淀，取得上清液置于真空干燥箱中60℃真空過夜，精密稱重，得到優(yōu)化馬錢子總生物堿，得率為（43.85±0.33）%（n=5）。

2.3 馬錢子優(yōu)化總生物堿的成分分析

2.3.1 酸性染料比色法測定純度[7]

磷酸氫二鈉1.681 8 g，磷酸二氫鈉0.315 1 g，用水溶解，定容至100 mL得pH 7.2磷酸鹽緩沖液。取pH 7.2的磷酸鹽緩沖液，溶解溴麝香草酚藍12.5 mg，定容至50 mL得顯色液。

分別取馬錢子優(yōu)化總生物堿和馬錢子堿適量，以氯仿定容，配制為0.10 mg/mL的氯仿溶液，制備供試液與對照品溶液。

取氯仿樣品溶液和對照品溶液各0.5 mL至錐形瓶，60℃真空干燥，加入4 mL顯色液，渦旋1 min，再加入6 mL氯仿，渦旋2 min，移至分液漏斗，靜置4 h后將氯仿層放出，倒入比色皿中進行比色測定，檢測到波長為416 nm，平行3份測定。另取0.5 mL氯仿作為空白對照，同法操作。以測得的馬錢子堿計的總生物堿含量除以稱重含量計算純度（%）。結(jié)果表明，制得的馬錢子優(yōu)化總生物堿以馬錢子堿計，其純度為（100.66±1.84）%（n=3）。說明所制得的馬錢子優(yōu)化總生物堿的純度很高。

2.3.2 HPLC法測定馬錢子堿與士的寧的含量

根據(jù)王絢等[8]的研究比較結(jié)果，本實驗選擇高效液相色譜法（HPLC）來測定馬錢子堿與士的寧的含量。

2.3.2.1 色譜 條 件KromasilC18（4.6mm×250mm，5μm），流動相：pH 2.8酸水（含0.02 mol/L磷酸二氫鉀與0.01 mol/L庚烷磺酸鈉等量混合溶液，用10%磷酸調(diào)節(jié)pH到2.8）∶乙腈=76∶24，流速：1 mL/min，檢測波長：264 nm，進樣量：10μL，柱溫：40℃。

2.3.2.2 對照品溶液和供試品溶液的制備 按《中國藥典》2010年版一部所述方法，各稱取馬錢子堿對照品10 mg、士的寧對照品10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加氯仿溶解定容。各取0.1 mL，用甲醇稀釋至5 mL于同一5 mL容量瓶中，搖勻即得對照品溶液和供試品溶液，其中每1毫升含馬錢子堿20μg和士的寧20μg。用氯仿將馬錢子優(yōu)化總生物堿溶解配制成10 mg/mL溶液，取適量用甲醇稀釋、定容到25μg/mL，進樣分析。按《中國藥典》2010年版方法，以對照品和供試品相應色譜峰面積值，采用外標一點法進行定量。色譜見圖1，測定結(jié)果見表1，可見優(yōu)化后士的寧的含量顯著下降，馬錢子堿與士的寧的比例為2.7∶1。

圖1 HPLC色譜

2.4 馬錢子優(yōu)化總生物堿的急性毒性研究

小鼠18～22 g，雌雄各半。受試藥物為馬錢子總生物堿和馬錢子優(yōu)化總生物堿，給藥途徑為尾靜脈注射。通過預實驗確定100%死亡組劑量Dm和0死亡組劑量Dn，馬錢子優(yōu)化總生物堿組在Dm（9 mg/kg）和Dn（1.575 mg/kg）的劑量范圍內(nèi)設4個劑量組，分別為2.161、3.087、4.410、6.300 mg/kg（劑量等比級數(shù)1∶0.7）。馬錢子總生物堿組在Dm（1.60 mg/kg）和Dn（0.272 mg/kg）的 劑 量 范 圍 內(nèi) 設4個 劑 量 組，分 別 為0.385，0.549，0.784，1.120 mg/kg（劑量等比級數(shù)1∶0.7）。每個劑量組10只小鼠。按Bliss法計算的實驗結(jié)果見表2?？梢?，優(yōu)化后馬錢子總生物堿的毒性顯著下降，LD50比優(yōu)化前提高了4.8倍。

表1 馬錢子總生物堿優(yōu)化前后的含量對比（±s，%，n=3）

表1 馬錢子總生物堿優(yōu)化前后的含量對比（±s，%，n=3）

成分 含量馬錢子堿優(yōu)化前優(yōu)化后24.02±2.12 51.60±1.44士的寧優(yōu)化前優(yōu)化后43.38±3.77 18.94±1.30

表2 馬錢子總生物堿優(yōu)化前后的急性毒性實驗結(jié)果比較

2 .5馬錢子優(yōu)化總生物堿的抗炎作用評價

精密稱取馬錢子總生物堿（馬錢子堿與士的寧含量比為1∶2）、馬錢子堿、優(yōu)化馬錢子總生物堿（馬錢子堿與士的寧含量比為1.8∶1）適量，用含20 %乙醇的PBS（pH＝7.4）溶解，濃度為1 mg/mL。

2.5.1 分組

實驗小鼠隨機分為7組，每組10只。分別為空白對照組；陽性組（云南白藥酊）；馬錢子總生物堿組；馬錢子堿組；優(yōu)化馬錢子總生物堿高、中、低劑量組。

2.5.2 給藥方案參照文獻[9]

于小鼠右耳涂抹20μL二甲苯，左耳作為對照不涂二甲苯，30 min后，于各組小鼠左右兩耳涂抹相應的受試藥物，空白組給予含20%乙醇的PBS，給藥組給予優(yōu)化馬錢子總生物堿，一共涂抹藥物3次，每次為80μL，間隔10 min，最后1次給藥40 min后將小鼠頸部脫臼處死，剪下左右兩耳，用直徑為6mm的打孔器在左右兩耳相同部位打下圓耳片并稱重。結(jié)果見表3。

可見，馬錢子優(yōu)化總生物堿的有效劑量為6 mg/kg，馬錢子優(yōu)化總生物堿抑制耳腫脹的效果顯著優(yōu)于馬錢子總生物堿。

表3 馬錢子優(yōu)化總生物堿小鼠耳腫脹實驗結(jié)果（±s，n=10）

表3 馬錢子優(yōu)化總生物堿小鼠耳腫脹實驗結(jié)果（±s，n=10）

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 劑量 耳腫脹度（mg）抑腫率（%）空白組陽性組馬錢子堿組馬錢子總生物堿組優(yōu)化馬錢子總生物堿低劑量組優(yōu)化馬錢子總生物堿中劑量組優(yōu)化馬錢子總生物堿高劑量組-240μL 12 mg/kg 12 mg/kg 3 mg/kg 6 mg/kg 12 mg/kg 12.80±2.31?8.20±2.38△△△12.12±2.75 12.01±0.85 10.93±1.92 10.20±3.14△9.37±1.80△△35.93 7.58 6.17 14.60 20.33 26.82

3 討論

本實驗中顯色液的pH值及吸收波長，對于用酸性染料比色法來測定總生物堿純度時對測定結(jié)果有很大影響，此結(jié)論在前期已通過實驗考察[6]，并確定最佳的pH值為7.2，測定波長為416 nm。總生物堿純度的測定結(jié)果表明馬錢子優(yōu)化總生物堿的純度很高，接近100%。

士的寧已經(jīng)被證明抗炎鎮(zhèn)痛效果較弱且毒性較強，例如有文獻證明非士的寧馬錢子總生物堿才是抗關節(jié)炎的主要有效部位[10]，因此將士的寧去除有利于減毒增效，但是要完全去除需要應用大孔吸附樹脂上柱洗脫，周期長，效率低。前期研究表明馬錢子堿和士的寧在50%乙醇中的溶解度分別為（455.40±0.03）和（1.60±0.03）mg/mL，溶解度相差近284倍，因此應用溶劑溶解分離就去除了絕大部分士的寧得到馬錢子優(yōu)化總生物堿，工藝簡單，有利于推廣應用。

藥效學研究表明，與馬錢子總生物堿相比，馬錢子優(yōu)化總生物堿經(jīng)皮給藥后對耳腫脹的抑制作用顯著增強；而急性毒性試驗結(jié)果也表明，靜脈注射途徑下，馬錢子優(yōu)化總生物堿的安全性提高了近5倍。這些試驗結(jié)果均表明，馬錢子優(yōu)化總生物堿可以實現(xiàn)減毒增效，本研究結(jié)果與其一致。

[1]蔡寶昌，吳皓，楊秀偉，等.馬錢子中16個生物堿類化合物13CNMR譜的數(shù)據(jù)分析[J].藥學學報，1994，29（1）：44-48.

[2]張婷，陳軍，王瑋，等.馬錢子堿脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的藥物動力學研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2012，28（1）：69.

[3]鄒龍，桂卉，黃世超，等.不同粒徑馬錢子粉體中士的寧在大鼠體內(nèi)的藥物動力學研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（12）：1568.

[4]賈旋旋，李文，李俊松，等.馬錢子的毒性研究進展[J].中國中藥雜志，2009，34（18）：2397-2399.

[5]于智敏，王克林，李海玉，等.常用有毒中藥的毒性分析與配伍宜忌[M].北京：科學技術文獻出版社，2005：59.

[6]Chen J，Wang X，Qu YG，et al.Analgesic and anti-inflammatory activity and pharmacokinetics of alkaloids from seeds of Strychnos nux-vomica after transdermal administration：Effect of changes in alkaloid composition[J].Journal of Ethnopharmacology，2012，139（1）：181-188.

[7]陳軍，蔡寶昌，沈春云，等.馬錢子總生物堿的含量測定[J].中藥新藥與臨床藥理，2007，18（6）：468-471.

[8]王絢，陳軍，蔡寶昌.馬錢子體內(nèi)外分析研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（13）：258-262.

[9]胡巍，陳軍，蔡寶昌，等.馬錢子堿經(jīng)皮給藥的鎮(zhèn)痛作用[J].中華中醫(yī)藥學刊，2008，26（2）：385-386.

[10]魏世超，徐麗君，張秀橋，等.馬錢子總生物堿對實驗性關節(jié)炎的影響[J].醫(yī)藥導報，2002，21（6）：335-336.