多電極記錄陣列：在腦片上研究癲癇的新工具☆

蔡國恩 張溥明 陸欽池 梁培基 葉欽勇

玻璃電極應(yīng)用于腦片上研究癲癇一直被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。然而，一種新的方法——多電極記錄(mμlti electrode arrays recording，MEA recording)——非侵入性的神經(jīng)細(xì)胞記錄被Thomas和Gross等[1-2]介紹進(jìn)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究。多電極記錄技術(shù)應(yīng)用于腦片記錄已經(jīng)超過10年時間，然而盡管其相對簡單，但是這種技術(shù)沒有被廣泛的應(yīng)用于理論和藥理學(xué)研究[3-4]。

在實(shí)驗(yàn)性癲癇研究中，低鎂誘導(dǎo)離體腦片的癲癇樣發(fā)作模型是一種被常用于離體研究癲癇的模型[5-7]。在本研究中采用傳統(tǒng)的由無鎂高鉀誘導(dǎo)的癲癇樣海馬切片作為研究對象，結(jié)合多電極記錄這項(xiàng)新技術(shù)，觀察多電極記錄運(yùn)用于癲癇研究及藥物治療的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)過程

1.1.1 基本介紹 運(yùn)用 MEA(mμlti Channel Systems MCS GmbH，German)(圖 1(a)(b))對 C57BL／6小鼠(鼠齡7～8周)的癲癇樣海馬切片的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行胞外記錄。

1.1.2 切片準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)選用 7周的 C57BL／6小鼠(由中科院上海生命科學(xué)院動物中心提供)，雄性。實(shí)驗(yàn)方法在先前已經(jīng)有描述[8-10]。將小鼠快速斷頭，快速浸入人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)，剝離顱骨和硬腦膜，取出腦組織，快速放入冰水混合ACSF中，迅速剝離出一側(cè)海馬，切成厚度為400 μm的海馬切片，然后快速移入ACSF中進(jìn)行孵育，在室溫(25℃)前后孵育1 h以上才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)記錄 用廣口吸管將一個海馬切片移到MEA上(圖1c)，調(diào)整好位置，然后用尼龍網(wǎng)固定切片。由蠕動泵將持續(xù)通于95%O2和5%CO2的混合氣體ACSF以2.5～3 mL／min的灌流切片(室溫25℃)。當(dāng)用ACSF灌流10 min以上后，換用持續(xù)通于95%O2和5%CO2的混合氣體的無鎂高鉀ACSF灌流切片，以形成癲癇樣的海馬腦片(癲癇樣放電達(dá)到6次／min以上入選實(shí)驗(yàn)組)，然后給予卡馬西平灌流30 min，給藥結(jié)束以后，再次給與無鎂高鉀的ACSF灌流40 min。神經(jīng)元發(fā)出癲癇樣波通過60道電極進(jìn)行同時記錄，后由商業(yè)軟件(MCRack)對神經(jīng)元反應(yīng)進(jìn)行采樣，存儲于計算機(jī)硬盤中，以備離線分析。采樣頻率為10 kHZ。

1.2 信號提取及數(shù)據(jù)分析 此過程由商業(yè)軟件(MCRack)進(jìn)行處理。動作電位提取出來以后，運(yùn)用MATLAB進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)處理作圖。具體可以參見本實(shí)驗(yàn)室以前發(fā)表的相關(guān)文章[11-13]。

2 結(jié)果

2.1 無鎂高鉀誘導(dǎo)腦片的癲癇樣放電特征 由MEA在此癲癇模型記錄觀察到，從開始給于無鎂高鉀灌流到開始出現(xiàn)癲癇樣放電的時間為：600±45 s(n＝8)。在出現(xiàn)相對大的癲癇樣放電事件之前一般都有出現(xiàn)相對較小的癲癇活動事件。場電位的幅值一般大于100 μV。經(jīng)過濾波后得到的癲癇樣放電的幅值在25～60 μV之間。

2.2 動作電位的檢測與提取 從癲癇樣海馬切片上得到的原始信號(圖2A)，經(jīng)過MCRack處理后得到的結(jié)果(圖2B)。在實(shí)驗(yàn)過程中，在只有當(dāng)發(fā)生如圖2A的癲癇樣放電的頻率大于6次／min的標(biāo)本才入選，在我們進(jìn)行的20多次成功的實(shí)驗(yàn)中，觀察到了相似的結(jié)果，雖然每次實(shí)驗(yàn)的海馬切片和電極陣列的相對位置隨機(jī)不固定的，但是在實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理過程中觀察到了相似的放電模式圖2。

2.3 神經(jīng)元放電的時空變化 給予腦脊液灌流腦片很少觀察到有自發(fā)放電，給予無鎂高鉀腦脊液灌流以后，會先觀察到神經(jīng)元明顯的興奮性表現(xiàn)，出現(xiàn)少量的自發(fā)放電，經(jīng)過一段時間的持續(xù)灌流，出現(xiàn)大量放電。CA1和CA3的放電比較明顯，表明海馬切片的癲癇模型具有區(qū)域特異性(圖3)。

圖1 A.MEA：1.石英玻璃；2.連接板；3.玻璃環(huán)；4.電極區(qū)。B.MEA芯片電極陣列詳細(xì)排列。C.海馬在MEA上的位置

圖2 MEA上記錄到的原始信號以及經(jīng)過MCRack處理以后的信號

2.4 卡馬西平在對海馬切片的癲癇活動的影響文獻(xiàn)報道卡馬西平可以對無鎂高鉀誘導(dǎo)的癲癇活動起抑制作用。在給予卡馬西平按照濃度遞增順序(10 μM，30 μM，100 μM)的實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加，癲癇樣放電被抑制得更加明顯，10 μM時海馬切片的放電基本保持不變，100 μM時海馬切片的放電基本被完全被阻斷(圖4)。同時我們觀察了苯妥英鈉對此癲癇模型的作用，發(fā)現(xiàn)1 mM的苯妥英鈉不能阻斷癲癇活動。

圖3 海馬切片的癲癇樣放電的區(qū)域特異性

圖4 不同濃度的卡馬西平對海馬切片的癲癇樣放電的抑制作用。A：示卡馬西平濃度為10 μM時c能量圖譜信號變化不大，說明腦片放電受抑制較弱；B：示卡馬西平濃度為30 μM時c能量圖譜信號輕度受抑制，說明腦片放電一定程度上受抑制；C：示卡馬西平濃度為100 μM時c能量圖譜信號基本消失，說明腦片放電受較強(qiáng)抑制

3 討論

長期以來，以玻璃電極為基礎(chǔ)的電生理技術(shù)已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)，對于神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展有相當(dāng)重要的貢獻(xiàn)。在癲癇的電生理研究中，一直以來都是通過玻璃電極來了解癲癇活動的，包括癲癇的發(fā)生機(jī)制以及藥理學(xué)研究，從而推動癲癇的研究的向前發(fā)展。然而MEA技術(shù)為癲癇的電生理研究提供一新的手段，它可以同時給與記錄和刺激，為癲癇的基礎(chǔ)和藥理學(xué)研究提供新的思路和新的方向。從神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說角度來看，耐藥性難治性癲癇的形成多數(shù)是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重組導(dǎo)致的[7]。龍莉莉的研究觀察到匹羅卡品致癇大鼠海馬中間神經(jīng)元變化表明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重要性[14]。 而MEA對研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有極大的相對優(yōu)勢。

無鎂高鉀的癲癇模型是一個傳統(tǒng)的模型，其通過不阻斷突觸間的NMDAR，而導(dǎo)致神經(jīng)元興奮，引起癲癇樣放電。在多電極陣列建立起癲癇模型，然后通過60個位點(diǎn)同步記錄，可以同時觀察到整個腦片的神經(jīng)元的放電反應(yīng)情況。圖3可以看出在海馬各個分區(qū)其癲癇樣放電是不一樣的。隨著海馬癲癇樣放電時間延長，海馬各個區(qū)域的放電發(fā)生變化，但是仍然以CA3區(qū)為主要的放電區(qū)域。

卡馬西平是通過阻斷鈉通道起抗癲癇作用，在以往的研究中[8]，卡馬西平在此癲癇模型當(dāng)中抑制了癲癇樣放電的發(fā)生。有許多學(xué)者通過玻璃電極在無鎂高鉀的海馬切片癲癇模型上得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是 10 μM的卡馬西平基本上沒有起作用，30 μM、100 μM卡馬西平能使突觸后電位的幅度與頻率均減少。從本研究圖4可以觀察到卡馬西平隨著濃度增加，癲癇波逐漸被抑制，100 μM基本被完全抑制。

上述研究說明了我們在MEA上建立起無鎂高鉀誘導(dǎo)的海馬切片癲癇模型是成功的，并初步運(yùn)用經(jīng)典的抗癲癇藥物驗(yàn)證了此模型，展示了MEA研究癲癇的優(yōu)勢。我們相信多電極記錄是可以更加推廣應(yīng)用于研究癲癇的新技術(shù)，但是需要進(jìn)一步探索最佳的研究方法。

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