新生淋巴管及其受侵對非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后價值

胡忠吾 王文利 張杰 毛鋒 申屠陽

淋巴系統(tǒng)是原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌（以下簡稱肺癌）主要的轉(zhuǎn)移途徑，也是影響患者預(yù)后的重要因素[1,2]。隨著新型淋巴內(nèi)皮特異性標(biāo)志物的開發(fā)，新生淋巴管形態(tài)學(xué)及腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究進(jìn)步卓著，在肺癌淋巴轉(zhuǎn)移領(lǐng)域的相關(guān)工作尤其活躍。本研究僅著眼于肺癌病灶及其周圍組織新生淋巴管的密度和受侵狀況，探討其對肺癌患者預(yù)后的判斷價值。

1 資料與方法

1.1 患者資料

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 2001年1月-2004年12月在上海市胸科醫(yī)院手術(shù)治療的肺癌患者，術(shù)后隨訪資料完整。符合下列條件者納入研究：①肺癌完全性切除（參照2005年IASLC肺癌完全性切除手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[3]）；②術(shù)前排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；③術(shù)后病理為鱗癌、腺癌或腺鱗癌；④術(shù)后病理分期按2009版UICC肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)[4]明確為I期-III期。剔除其中術(shù)前行放化療及術(shù)后非腫瘤原因死亡病例。

1.1.2 資料收集 入組患者共79例，其中石蠟組織標(biāo)本中含病灶旁組織者45例，詳見表1。隨訪截止日期為2009年6月8日，隨訪資料均來源于上海市疾病預(yù)防控制中心。采集以下資料：住院號、性別、年齡、手術(shù)日期、手術(shù)類型、病理類型、分化程度、T分期、N分期、淋巴結(jié)清掃數(shù)量及站別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

1.2 研究方法

1.2.1 研究對象 肺癌患者術(shù)后病灶石蠟標(biāo)本，共計(jì)79塊。

1.2.2 方法與程序 ①將病灶石蠟塊切成3 μm厚度，二甲苯脫蠟至水化后，3%H2O2處理10 min去除過氧化物酶，放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH7.4）的容器中，高壓蒸汽修復(fù)抗原，煮沸即可，室溫冷卻，切片再用PBS沖洗3次，每次3 min；②D2-40單克隆抗體（Myboisource, US）采用PBS稀釋，按1:50濃度進(jìn)行稀釋，封閉靶抗原后，4 °C冰箱下恒溫儲存；③二抗加兔抗鼠Envinsion（DAKO公司，US）室溫30 min溫育，PBS沖洗3次；④滴加新鮮配制DAB顯色液（DAKO公司，US），顯微鏡下觀察5 min-10 min，在顯色最佳時用PBS沖洗，中止顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，然后水洗、藍(lán)化、脫水、中性樹膠封片。

1.2.3 病灶內(nèi)新生淋巴管密度的定量測定 病灶內(nèi)新生淋巴管的密度（intratumoral lymphatic vessel density, ITLVD）的評測根據(jù)Weidner[5]方法。光學(xué)顯微鏡下觀察切片，先在100倍鏡下選擇有明確染色表達(dá)的新生淋巴管區(qū)域（俗稱“熱點(diǎn)”區(qū)域），每個切片樣本選擇5個“熱點(diǎn)”區(qū)域，繼而在200倍鏡下計(jì)數(shù)每例切片新生淋巴管數(shù)量，單位為個，以Mean±SD表示。

1.2.4 病灶旁新生淋巴管密度的定量測定 病灶旁組織新生淋巴管密度（peritumoral lymphatic vessel density,PTLVD）定義為在腫瘤邊緣附近500 μm區(qū)域內(nèi)的新生淋巴管密度。由于多數(shù)的標(biāo)本癌旁組織較少，故在鏡下取2個-5個“熱點(diǎn)”區(qū)域，200倍鏡下觀察計(jì)數(shù)每例切片單位視野平均新生淋巴管數(shù)，單位為個，以Mean±SD表示。

1.2.5 新生淋巴管受侵的定義 即新生淋巴管受到腫瘤細(xì)胞侵犯（lymphatic vessels invasion, LVI），鏡下病灶中或病灶旁組織中的新生淋巴管管腔中存在腫瘤細(xì)胞團(tuán)，即為新生淋巴管受侵，以LVI+表示，無新生淋巴管受侵以LVI-表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。分析總體率或構(gòu)成比之間有無差異采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier乘積法和Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸模型。由于新生淋巴管密度呈非正態(tài)分布，相關(guān)因素比較采用Mann-Whitny U檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病灶內(nèi)新生淋巴管及其受侵

2.1.1 病灶內(nèi)新生淋巴管的表達(dá)及其形態(tài) D2-40特異性標(biāo)記的新生淋巴管顯示為棕黃色的單層薄壁管腔，管壁無肌細(xì)胞和周細(xì)胞，管腔內(nèi)無紅細(xì)胞。病灶內(nèi)新生淋巴管的典型圖像見圖1及其描述。

2.1.2 ITLVD ITLVD為11.3±7.9。對相關(guān)因素進(jìn)行Mann-Whitny U檢驗(yàn)，研究病灶內(nèi)新生淋巴管密度與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果詳見表2。

2.1.3 病灶內(nèi)新生淋巴管受侵 47例N0組患者中有9例LVI+，而32例N2組患者中有14例LVI+，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.019），病灶內(nèi)新生淋巴管受侵的典型圖像見圖2及其描述，而性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度和病理類型等因素與之無相關(guān)性，具體數(shù)據(jù)詳見表2。

2.1.4 生存分析 79例患者中，低ITLVD組者（≤11.3個）35例，高ITLVD組者（＞11.3個）44例， 其總體5年生存率為57%。單因素生存分析顯示高ITLVD（P=0.007）及LVI+（P=0.004）是影響預(yù)后的重要因素（圖3）。Cox多因素回歸模型顯示：高ITLVD、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑及分化程度是影響患者預(yù)后的重要因素（表3）。

2.2 病灶旁新生淋巴管及其受侵

2.2.1 病灶旁新生淋巴管的表達(dá)及典型圖像 79例入組患者中，含病灶旁組織者共45例，病理特征詳見表1。病灶旁新生淋巴和病灶內(nèi)新生淋巴管形態(tài)相似，非均勻出現(xiàn)在病灶旁組織中。其特征性典型圖像見圖4及其描述。

圖1 病灶內(nèi)新生淋巴管的表達(dá)。A：40倍顯微鏡下所顯示的鱗癌組織內(nèi)新生淋巴管的表達(dá)；B：100倍顯微鏡下所顯示的腺癌組織內(nèi)新生淋巴管的表達(dá)。Fig 1 The expression of lymphangiogenesis in tumor tissue under microscope. A: The expression of lymphangiogenesis in lung squamous carcinoma tissue (×40, IHC stain,brown granules)； B: The expression of lymphangiogenesis in lung adenocarcinoma tissue (×100, IHC stain, brown granules).

圖2 病灶內(nèi)新生淋巴管受侵Fig 2 The red arrow showed tumor cell invade the lymphangiogenesis in tumor tissue (Squamous carcinoma, IHC stain, original magnification×200).

表1 入組患者臨床特征Tab 1 The characteristics of eligible patient

2.2.2 PTLVD 45例患者PTLVD為（7.8±5.2）個。對相關(guān)因素進(jìn)行Mann-Whitny U檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：病灶旁組織新生淋巴管的表達(dá)與患者性別、年齡、LVI、腫瘤直徑、淋巴結(jié)分期、腫瘤分化程度及病理類型等無相關(guān)性（表4）。

2.2.3 病灶旁新生淋巴受侵 45例患者中LVI+者共12例。LVI+與患者性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)分期、腫瘤分化程度及病理類型等亦無相關(guān)性（表4）。

2.2.4 生存分析 45例患者分為低PTLVD組（≤7.8個）28例，高PTLVD組（＞7.8個）17例。單因素生存分析顯示PTLVD的高低與患者預(yù)后無明顯相關(guān)性（P=0.278）；而LVI+仍是影響預(yù)后的重要因素（P=0.004）（圖5）。Cox多因素回歸模型顯示： 淋巴結(jié)分期、腫瘤直徑及腫瘤分化程度是影響患者術(shù)后預(yù)后的重要因素（表5），而與PTLVD水平無明顯相關(guān)性（P=0.704）。

3 討論

現(xiàn)有研究認(rèn)為，腫瘤病灶內(nèi)新生淋巴管是淋巴轉(zhuǎn)移的預(yù)設(shè)途徑，細(xì)胞因子則在淋巴管和腫瘤細(xì)胞的相互關(guān)聯(lián)中發(fā)揮重要作用。原發(fā)腫瘤分泌的淋巴生長因子誘導(dǎo)腫瘤病灶及其周圍的淋巴管生成，從而構(gòu)成轉(zhuǎn)移通路。腫瘤細(xì)胞則通過這些淋巴管擴(kuò)散進(jìn)入淋巴結(jié)，并進(jìn)一步介導(dǎo)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6-8]。隨著淋巴內(nèi)皮特異性標(biāo)志物的逐漸發(fā)現(xiàn)，有關(guān)新生淋巴管的研究在機(jī)制、形態(tài)、功能等層面均有所進(jìn)展[9]。Nakamura等[10]對于早期胃癌的研究顯示，無論病灶內(nèi)還是病灶旁新生淋巴管對腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移都有重要意義，是淋巴轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素之一。Maula等[11]對頭頸腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，病灶內(nèi)新生淋巴管的表達(dá)水平與局部淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，是重要的預(yù)后因素。在胰腺腫瘤中亦發(fā)現(xiàn)高病灶內(nèi)淋巴管密度與淋巴及血管侵犯相關(guān)，提示病灶新生淋巴管促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[12]。

表2 病灶內(nèi)新生淋巴管密度/淋巴管受侵與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 The relationship between ITLVD/LVI and clinicopathological characteristics

表3 79例非小細(xì)胞肺癌患者生存期的預(yù)后因素（Cox回歸分析）Tab 3 Prognostic factors for survival in 79 non-small cell lung cancer (NSCLC) patients (Cox regression model)

圖3 Kaplan-Meier累計(jì)生存時間曲線分析。A：高ITLVD組患者和低ITLVD組患者的Kaplan-Meier累計(jì)生存時間曲線；B：病灶LVI+組與LVI-組的Kaplan-Meier累計(jì)生存時間曲線。Tab 3 Kaplan-Meier cumulative survival time curves analysis. A: Kaplan-Meier cumulative survival time curves of higher ITLVD (＞11.3) and lower ITLVD (≤11.3)； B: Kaplan-Meier cumulative survival time curves of LVI+ group and LVI- group in tumor tissue.

圖4 病灶旁新生淋巴管的表達(dá)（紅色梯形區(qū)域）。A：100倍顯微鏡下所顯示的腺癌癌旁組織內(nèi)新生淋巴管的表達(dá)；B：200倍顯微鏡下所顯示的腺鱗癌癌旁組織內(nèi)新生淋巴管的表達(dá)。Fig 4 The red trapezoidal area showed the expression of lymphangiogenesis in peritumor tissue under microscope.A: Lung adenocarcinoma (×100, IHC stain, brown granules)； B: Lung adenosquamous carcinoma (×200, IHC stain, brown granules).

表4 病灶旁新生淋巴管密度/淋巴管受侵與臨床病理特征的關(guān)系Tab 4 The relationship between PTLVD/LVI and clinicopathological characteristics

表5 45例NSCLC患者生存期的預(yù)后因素（Cox回歸分析）Tab 5 Prognostic factors for survival in 45 NSCLC patients (Cox regression model)

本研究發(fā)現(xiàn)，高ITLVD與患者縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是重要預(yù)后因素。提示腫瘤內(nèi)新生淋巴管可能增加腫瘤細(xì)胞與淋巴管的接觸面積，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。非小細(xì)胞肺癌患者ITLVD和淋巴管侵犯的程度具有相關(guān)性，ITLVD越高，癌細(xì)胞侵犯淋巴管的可能性越大，越有利于癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。低分化腫瘤患者的ITLVD也較高，更易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。這與上述文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)論基本相同。肺腺癌患者ITLVD較高，該類患者較之鱗癌更易出現(xiàn)縱隔淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。我們前期的工作[13]顯示，腺癌病灶新生淋巴管密度平均為6.20±3.81，明顯高于鱗癌組（3.18±3.95, P=0.001），且與患者年齡、性別、T分期及腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性。但亦有研究顯示鱗癌病灶中ITLVD較高[14]。

在病灶內(nèi)，本研究單因素分析顯示LVI與ITLVD存在正相關(guān)性，即病灶中新生淋巴管密度愈高，其受侵的機(jī)率亦隨之增加。LVI尤其與縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系較為密切，N0組：9/47者LVI+，N2組：14/32者LVI+，兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯（P=0.019）。但在多因素分析中并未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故尚待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本深入研究。然而值得注意的是，生存率分析提示，無論病灶內(nèi)還是病灶旁組織，LVI+組與LVI-組的生存曲線較早即出現(xiàn)明顯分離，LVI+組生存率急劇下降（圖3B及圖5），提示LVI+對生存率的影響不容小覷，值得進(jìn)一步研究。

2009年世界肺癌大會發(fā)布的第7版肺癌分期，按腫瘤直徑細(xì)化T分期，更提升了腫瘤直徑對預(yù)后影響的重要性。本研究中多因素分析亦顯示腫瘤直徑是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的重要因素。Kadota等[14]在針對非小細(xì)胞肺癌患者的新生淋巴管研究中指出，直徑3 cm以上的腫瘤，其新生淋巴管密度明顯大于直徑3cm以下者。本文表2亦可發(fā)現(xiàn)，直徑＜3 cm的腫瘤ITLVD為（9.8±4.9）個，總體低于腫瘤直徑＞3 cm-≤5 cm和＞5 cm者（分別為11.6±10.7和13.1±8.8），隨著病灶直徑的增加ITLVD呈現(xiàn)逐步升高趨勢。

本研究通過對45例患者病灶旁組織的分析顯示，PTLVD與患者預(yù)后無明顯相關(guān)性（P=0.278）。但Sun等[15]研究認(rèn)為，在非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移過程中，病灶旁新生淋巴管發(fā)揮著重要作用，而病灶內(nèi)新生淋巴管可能并無重要意義。結(jié)果的不一致可能因該組患者樣本量較少，且部分癌旁組織在整張切片中所占面積較小，從而影響對PTLVD的客觀評價，故有待擴(kuò)大樣本研究。亦有部分研究[16,17]指出高PTLVD組有較好的預(yù)后：在某些腫瘤中，病灶周圍數(shù)目眾多的功能性淋巴管網(wǎng)能夠誘發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，同時腫瘤細(xì)胞通過分泌VEGF-C/D促進(jìn)新生淋巴管的生成，提高了癌旁組織淋巴管的密度，有利于免疫細(xì)胞趨化到腫瘤周圍組織，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。此外，盡管大部分研究都提示腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移與新生淋巴管有關(guān)，但亦有研究指出腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散可能是通過預(yù)先存在的淋巴管。Leu等[18]通過對鼠肉瘤淋巴管的研究，質(zhì)疑新生淋巴管對腫瘤侵犯及轉(zhuǎn)移的作用，提出在病灶中或者病灶周圍原先存在的淋巴管才是影響腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。這些研究中的結(jié)論差異，一方面說明新生淋巴管功能的復(fù)雜多樣，另一方面也反映了各研究的局限性，有待時日和深入研究，才能全面客觀地揭示其真相。

綜上所述，雖然存在分歧，但是大多數(shù)研究仍然肯定新生淋巴管在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制中的重要作用。就我們有限病例的研究而言，病灶內(nèi)新生淋巴管密度是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的重要因素，可作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。病灶旁新生淋巴管密度的預(yù)后意義有待大樣本進(jìn)一步研究。而病灶內(nèi)和病灶旁新生淋巴管受侵與淋巴轉(zhuǎn)移和生存率關(guān)系密切，值得關(guān)注。